研究背景与目的巢蛋白(nestin)归为第六类中间丝蛋白,主要分布在细胞浆内。巢蛋白在神经系统、胰腺、心肌、骨骼肌、牙齿、肾上腺、睾丸、肿瘤中均有表达。1985年Hockfield和Mckay首先发现,nestin在胚胎大鼠脊髓神经管神经前体细胞中表达。nestin在胚胎的早期发育如神经管的发育、原肠胚和一些器官的形成过程中高表达,随着发育的成熟,nestin表达逐渐下降,最后消失,在成体细胞中不表达,但在组织发生损伤的时候,部分细胞可以观察到重新表达nestin。最近越来越多的研究发现nestin不仅在中枢神经系统肿瘤中表达,在乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺肿瘤以及黑色素瘤等多种肿瘤中也有表达。项鹏等发现,nestin可以在恶性血管内皮细胞瘤、胰腺腺泡癌和胃肠间质瘤中表达,并且其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。体外研究表明,nestin参与细胞增殖、迁移和分化等过程。Li-chun wei等观察到抑制nestin表达后对星型胶质细胞瘤的生长有明显的抑制作用,但Ki-67的表达并不减少,可见nestin与细胞的增殖无直接关系。另外有研究发现,nestin可通过Cdk5／p35信号通路增强细胞生存能力,抑制凋亡发生。体内研究发现,nestin基因敲除后使斑马鱼脑和眼发育障碍,主要由于细胞凋亡增加引起；而在nestin敲减后的小鼠大脑皮层中,神经元的形成明显减少,主要由于细胞增殖减少所致。然而,也有研究发现,nestin可能和糖皮质激素受体结合后使PI3K活性增强,通过下游的一系列酶促反应促进细胞进入增殖周期。已有研究发现,PDGF, Thrombin等细胞生长因子可增强nestin的表达从而调控细胞的增殖和／或存亡。例如,PDGF(曾报道可促进肾小管上皮细胞的增殖)可上调nestin的表达；体外实验表明Thrombin可上调nestin的表达从而促进星型胶质细胞的增殖。这些发现说明了细胞生长因子信号通路可调控nestin的表达,从而促进细胞的增殖和存活。以上研究表明,nestin的体内功能复杂,nestin是促进细胞的增殖或者是抑制其凋亡仍然存在争议。Nestin作为神经干细胞的标志物,其表达模式特别,一般情况下只表达于未分化成熟的细胞,细胞分化成熟后其表达下降甚至不表达。为此,我们提出假设,nestin过表达后能否维持细胞的增殖状态?发育过程中过表达nestin能否影响细胞的正常凋亡?作为研究基因功能的一种重要作用手段,基因过表达技术备受大家青睐。到目前为止,nestin过表达转基因小鼠体能功能的研究迄今尚无相关的报道。为了进一步研究nestin的体内功能,我们课题组前期已经成功构建了nestin过表达转基因小鼠。前期的工作中发现,nestin过表达后可促进肝脏损伤后肝细胞的再生增殖能力。本课题旨在利用该转基因小鼠研究nestin过表达后对小鼠胚胎发育的影响,以便进一步探讨nestin的体内功能。研究内容与方法1.nestin在转基因动物胚胎主要器官中的表达水平采用PCR、Q-PCR. Western blotting方法从DNA、mRNA以及蛋白水平检测nestin转基因小鼠胚胎主要器官(脑、心脏、肝脏、肺、皮肤)中外源基因nestin的表达情况。2. nestin对转基因小鼠胚胎生长的影响收集E11.5至E18.5发育阶段的nestin转基因小鼠和野生型小鼠胚胎标本,肉眼观察比较转基因小鼠和野生型小鼠胚胎生长发育的差异。HE染色比较转基因鼠和野生型鼠胚胎各器官的形态学差异。3. nestin对转基因鼠心脏和脑组织增殖及凋亡的影响采用Brdu和TUNEL实验检测转基因小鼠和野生型小鼠胚胎心脏和前脑组织中增殖以及凋亡的细胞差异情况。同时采用免疫组化法检测转基因小鼠前脑组织细胞的分化情况,免疫荧光双标记实验检测前脑组织中增殖的细胞是否为神经干细胞。4. nestin基因过表达对PI3K/Akt信号通路的影响采用Western blotting方法从体内水平检测nestin转基因小鼠胚胎心脏和脑组织中PI3K/Akt信号通路的激活情况,以及检测casepase3和BCL2凋亡相关基因的变化情况。结果1.转基因小鼠胚胎主要器官中存在较高水平的外源基因nestin的表达利用PCR法检测转基因小鼠外源基因nestin在DNA水平的整合情况,结果表明,与普通野生型小鼠相比,转基因小鼠在大约500bp处检测到阳性信号；利用Q-PCR法检测转基因小鼠胚胎主要器官(心脏、脑、肝脏、肺、皮肤)中外源基因nestin在mRNA水平的表达情况,结果表明,与普通野生型小鼠胚胎相比,转基因小鼠胚胎主要器官中存在较高水平的nestin外源基因的表达。利用Western blotting方法检测转基因小鼠胚胎主要器官(心脏、脑、肝脏、肺、皮肤)中nestin在蛋白水平的表达情况,结果表明,与野生型小鼠胚胎相比,nestin转基因小鼠胚胎主要器官中存在较高水平的外源基因nestin的表达。2. Nestin过表达促进胚胎小鼠心脏和前脑的生长发育我们分别收集了11.5至18.5天的转基因小鼠和野生型小鼠胚胎,肉眼观察结果显示,在E11.5和E12.5时转基因小鼠和野生型小鼠胚胎体积无明显差异。但从E13.5开始,转基因小鼠胚胎体积明显大于野生型小鼠(以顶臀长度为标准)。其中在E13.5,E14.5时胚胎外形差异最为明显。转基因小鼠和野生型小鼠胚胎均未见出血,水肿,吸收等现象。利用HE染色法观察转基因小鼠和野生型小鼠各器官形态学的变化情况,结果显示,在E13.5、E14.5、E15.5发育阶段,转基因小鼠相比于野生型小鼠,其心脏体积明显增大,心室心肌细胞体积明显增大,心肌小梁及心肌致密层增厚,心肌细胞分裂活跃,可见双核。另外,在E13.5天,我们观察到转基因小鼠相比于野生型小鼠,其前脑泡腔体积明显增大,皮质增厚,细胞数明显增多,细胞核大,核仁明显,大部分细胞处于增殖分裂状态。同时,我们使用显微镜1um标尺测量心室心肌致密层、心肌小梁、脑皮质厚度。每个组织分成6个小区域分别测量；另外,使用Image-Pro Plus software测量心肌细胞和脑细胞的相对体积。结果示：E13.5胚胎心脏,转基因小鼠心肌致密层厚度为51±9μm,约为野生小鼠的2倍(野生鼠23±6μm,n=6,P<0.05),转基因小鼠心肌小梁厚度为19±4μm,约为野生小鼠的1.3倍(野生鼠14±2μm, n=6, P<0.05); Image-Pro Plus software测量结果示：转基因小鼠心肌细胞体积为3698±1440,而野生小鼠心肌细胞体积为1050±452,差别具有统计学意义(n=50,P<0.0001)。E14.5胚胎心脏,转基因小鼠心肌致密层厚度为60±4μm,约为野生小鼠的2倍(野生鼠26±5μm,n=6,P<0.05),转基因小鼠心肌小梁厚度为20±4μm,约为野生小鼠的1.3倍(野生鼠15±2μm,n=6,P<0.05)；Image-Pro Plus software测量结果示：转基因小鼠心肌细胞体积为3883±1163,而野生小鼠心肌细胞体积为1209±427,差别具有统计学意义(n=50,P<0.0001)。E15.5胚胎心脏,转基因小鼠心肌致密层厚度为73±8μm,约为野生小鼠的1.8倍(野生鼠42±3μm,n=6,P<0.05),转基因小鼠心肌小梁厚度为25±3μm,约为野生小鼠的1.4倍(野生鼠18±μm, n=6, P<0.05); Image-Pro Plus software测量结果示：转基因小鼠心肌细胞体积为3900±1262,而野生小鼠心肌细胞体积为1274±479,差别具有统计学意义(n=50,P<0.0001)。E13.5胚胎前脑,转基因小鼠脑皮质厚度为324±97μm；野生小鼠脑皮质厚度为157±82μm,差别具有统计学意义(n=6, P<0.05); Image-Pro Plus software测量结果示：转基因小鼠脑细胞体积为3688±2839,而野生小鼠脑细胞体积为753±334,差别具有统计学意义(n=50,P<0.0001)。观察出生后1年小鼠,转基因小鼠可养活,肥沃,未出现早期死亡以及心脏和神经管等器官缺陷现象。3. Nestin过表达后促进细胞的增殖,而对凋亡作用不明显在发育过程中,器官的大小主要取决于细胞增殖和凋亡的平衡发展。为了确定nestin过表达后是否促进小鼠心脏和脑的增殖状态。我们采用Brdu法检测nestin过表达转基因小鼠胚胎心脏和前脑组织中细胞的增殖情况。怀孕母鼠在E13.5、E14.5、E15.5时腹腔注射Brdu(按120mg/kg体重),注射后6h收集胚胎,Brdu一抗(1：20稀释)4℃孵育过夜,HRP标记的鼠二抗孵育1h。DAB复染Brdu阳性细胞核。转基因鼠和野生鼠各取3个胚胎,每个标本做5张切片,低倍视野下计数Brdu阳性细胞占细胞总数的百分比。结果表明,在E13.5、E14.5、E15.5发育阶段,转基因小鼠胚胎心脏增殖的细胞较野生型小鼠明显增多,其中E13.5天增多13%(P=0.0024),E14.5天增多24%(P=0.0007)；E15.5天增多5.5%(P=0.015)。另外,在E13.5时,前脑泡腔中,转基因小鼠Brdu阳性细胞百分比较野生型小鼠增多32%(P=0.016)。另外,为了明确转基因小鼠脑皮质增多的细胞是否由于神经胶质细胞分化增多所致。我们采用GFAP(胶质纤维酸性蛋白)检测小鼠前脑组织中细胞的分化情况。结果显示,转基因小鼠和野生小鼠前脑组织中均为见GFAP阳性细胞。该结果表明,nestin过表达不影响脑细胞的分化。为了进一步明确脑组织中增殖的细胞是否为神经干细胞,我们采用免疫荧光双标记实验检测SOX2(神经干细胞的标志物)和Ki67(细胞增殖指标)共表达情况,结果表明,与野生小鼠相比,转基因小鼠脑组织中SOX2和Ki67阳性细胞明显增多,大部分Ki67标记细胞同时共表达SOX2。该实验结果表明,前脑组织中增殖的细胞大部分为神经干细胞。另外,为了进一步明确nestin过表达后是否对小鼠心脏和脑具有抗凋亡作用。我们采用TUNEL原位标记小鼠心脏和前脑组织中凋亡的细胞。结果显示,转基因小鼠和野生型小鼠胚胎心脏和前脑组织中均只见个别散在的凋亡细胞,两者无明显差异。4. Nestin基因过表达促进PI3K/Akt信号通路的激活采用western blotting方法从体内水平检测转基因小鼠心脏和脑组织中PI3K/Akt信号通路的激活情况,以及casepase3和BCL2凋亡相关基因的变化情况,以β-actin为内参。Western blot结果显示,在E13.5天,与普通野生型小鼠胚胎相比,nestin过表达转基因小鼠胚胎心脏和脑组织中p-PI3K、 p-Akt的表达均上调。说明nestin过表达后导致PI3K/Akt信号通路磷酸化水平增高。另外,转基因小鼠和野生型小鼠胚胎心脏和脑组织中,casepase3和BCL2凋亡相关基因变化无明显差异。结论1.相对于普通野生型小鼠,nestin转基因小鼠胚胎主要器官(心脏、脑、肝脏、肺、皮肤)中存在较高水平的外源基因nestin的表达。该结果表明,外源性nestin基因在转基因小鼠基因组中稳定存在并可行使功能,因此该转基因小鼠可用于研究nestin的体内功能。2.相对于普通野生型小鼠,nestin转基因小鼠胚胎体积明显增大,心脏和前脑组织体积增大,心肌细胞和脑细胞胞体增大,细胞数量增加。该结果表明,nestin过表达可促进胚胎小鼠的生长发育。3. Nestin转基因小鼠胚胎心脏和前脑组织中增殖的细胞明显多于野生型小鼠,而凋亡细胞与野生小鼠相比无明显差异。该结果表明,nestin过表达后通过促进细胞的增殖从而影响小鼠心脏和脑的生长发育。4. Nestin基因过表达后导致P-PI3K、p-Akt表达上调,另外casepase3和BCL2凋亡相关基因无明显变化。该实验结果提示：nestin可能作为PI3K/Akt信号通路的上游调控基因,通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞的增殖从而影响胚胎器官的生长发育。