【摘 要】
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目的:本实验拟探索在胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖及迁移能力的变化,并初步探讨长链非编码RNA PVT1在这种变化中的作用及机制。方法:第一部分:采用Transwell小室对C6细胞和BMSCs细胞进行间接共培养模拟胶质瘤C6细胞微环境。以正常培养的BMSCs为对照组,共培养后的BMSCs的增殖能力、克隆形成能力、细胞周期和迁移能力的变化分别通过CCK8、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术、划痕
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目的:本实验拟探索在胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖及迁移能力的变化,并初步探讨长链非编码RNA PVT1在这种变化中的作用及机制。方法:第一部分:采用Transwell小室对C6细胞和BMSCs细胞进行间接共培养模拟胶质瘤C6细胞微环境。以正常培养的BMSCs为对照组,共培养后的BMSCs的增殖能力、克隆形成能力、细胞周期和迁移能力的变化分别通过CCK8、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell迁移实验检测;共培养BMSCs中miR-134-5p的表达变化通过RT-qPCR检测;通过文献查找选出在胶质瘤中高表达的lncRNA,然后通过RNA22 v2 micro RNA target detection软件预测筛选和miR-134-5p具有结合位点的候选lncRNA;通过RT-qPCR筛选出在共培养BMSCs中高表达的lncRNA,确定候选lncRNA用于后续实验。第二部分:通过siRNA片段将共培养组BMSCs中PVT1的表达进行敲低,RT-qPCR检测敲低效率,CCK8、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验及Transwell迁移实验分别检测PVT1对共培养BMSCs的增殖能力、克隆形成能力、细胞周期及迁移能力的影响。第三部分:通过RT-qPCR检测PVT1对miR-134-5p表达的影响;PVT1与miR-134-5p靶向结合的可能性通过双荧光素酶报告基因实验检测;共转染si-PVT1和miR-134-5p inhibitor至共培养BMSCs,检测转染后共培养BMSCs的增殖、克隆形成及迁移能力,RT-qPCR检测转染后各组细胞中miR-134-5p和STAT3 m RNA的表达,WB检测转染后各组细胞中STAT3蛋白的表达。结果:第一部分:与C6细胞间接共培养后BMSCs增殖及迁移能力均明显增强,且BMSCs单细胞在软琼脂中具有形成克隆球的能力;共培养组BMSCs细胞中miR-134-5p的表达较对照组明显降低;通过查阅大量文献,共有50个已报道的在胶质瘤中高表达的lncRNA,RNA22 v2micro RNA target detection软件预测筛选出3个与miR-134-5p可能具有结合关系的lncRNA,RT-qPCR分别检测3个lncRNA在共培养BMSCs和正常BMSCs中的表达,结果显示PVT1在共培养BMSCs中明显高表达,因此确定PVT1作为进一步研究对象。第二部分:转染si-PVT1片段后,共培养BMSCs中PVT1表达明显降低,PVT1敲低后共培养BMSCs增殖活力明显受抑,克隆球形成数量明显减少,G0/G1期的细胞增多,S期细胞减少,细胞出现G0/G1期阻滞,细胞横向和纵向迁移能力均减弱。第三部分:PVT1敲低后miR-134-5p表达较对照组明显上调;miR-134-5p mimics与PVT1-WT共转染组荧光素酶活性较其他组并无明显降低;si-PVT1和miR-134-5p inhibitor共转染组细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移能力较单独转染si-PVT1组细胞均明显增强;miR-134-5p在转染si-PVT1组表达上调,而在共转染si-PVT1和miR-134-5p inhibitor组表达下降;STAT3 m RNA和蛋白在转染si-PVT1组表达下降,共转染si-PVT1和miR-134-5p inhibitor组表达上升。结论:1.胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖、克隆形成及迁移能力均明显增强;2.与对照组BMSCs相比,共培养组BMSCs中miR-134-5p表达降低,PVT1表达增加;PVT1具有促进胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖、克隆形成和迁移能力的作用;3.PVT1通过抑制miR-134-5p促进STAT3的表达,促进胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs的增殖和迁移能力。
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