中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)即河蟹、大闸蟹,在我国淡水养殖业中占有相当大的比重,能够创造巨大的经济价值。近年来,伴随养殖规模不断扩大、养殖密度迅速增加,中华绒螯蟹的患病几率也大大增加,主要由细菌、病毒和寄生虫引起。其中,中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma ericheiris)作为一种新型致病菌,能引发中华绒螯蟹患“颤抖病”,所造成的危害最为严重。基于前期中华绒螯蟹血细胞免疫蛋白组学筛选结果可知,转铁蛋白(EsTTF)以及铁蛋白(EsFe1、EsFe2)在螺原体感染中华绒螯蟹后,在血细胞中的表达量发生显著变化。此外,先前已有报道证实转铁蛋白和铁蛋白曾参与了其他物种宿主的免疫反应。综上所述,我们推断EsTF、EsFe1和EsFe2极有可能在中华绒螯蟹的免疫防御机制中发挥的重要的作用。本论文首先通过基因克隆及生物信息学分析的方法,对EsTF的生物学特性进行了研究。其次,通过qRT-PCR的方法检测外源补充铁元素及螺原体刺激后EsTF、EsFe1和EsFe2的表达变化。依据实验结果,我们初步推断这三个蛋白以及铁元素可能在抵御螺原体侵染中华绒螯蟹的免疫反应中发挥了作用。进一步地,本文的研究也为我们对中华绒螯蟹免疫防御机制的探究提供了前期基础,并在一定程度上为降低螺原体造成的危害提供实验和理论根据。具体的实验研究内容将从以下两个方面开展:1、中华绒螯蟹EsTF的基因克隆及生物信息学分析本实验提取中华绒螯蟹血细胞的总RNA,通过RACE技术成功扩增了中华绒螯蟹EsTF的基因全长。EsTF序列全长为2974 bp,开放阅读框大小为2193 bp,能编码730各氨基酸,分子量为79.59 kDa,等电点为6.87。经生物信息学分析可知,EsTF的1-19氨基酸位点为信号肽,含有两个高度保守的TR_FER结构域。同源序列及进化分析可知,EsTF与其他无脊椎动物的转铁蛋白具有相似的保守结构域,并且亲缘关系也很近,证明EsTF在进化上较保守。组织分布结果表明,EsTF在神经组织中转录水平最高,在肠中的也有较高的转录水平。综合以上的实验结果,我们对EsTF的生物学特性有了更全面的了解,为进一步开展免疫功能的研究奠定了基础。2、中华绒螯蟹的EsTF、EsFe1和EsFe2免疫功能的初步研究转铁蛋白和铁蛋白是铁元素代谢调节的重要蛋白,负责铁元素的转运和存储,众多研究表明其在无脊椎动物的先天性免疫过程当中发挥了重要作用。经螺原体刺激后,通过qRT-PCR检测中华绒螯蟹血细胞中EsTF、EsFe1和EsFe2的转录水平的变化,结果表明三者mRNA的转录水平均明显高于对照组(PBS组)。外源补充了铁元素后,qRT-PCR检测可知,EsTF、EsFe1和EsFe2的表达量均增多。若外源补充铁元素后再利用螺原体刺激中华绒螯蟹,qRT-PCR检测结果显示,这三个基因mRNA的转录水平均仍都高于PBS组,但要却低于单独螺原体刺激的组和铁元素对照组。此外,我们还发现外源补充铁元素组螺原体的拷贝数明显减少,中华绒螯蟹的颤抖病爆发速度减慢,死亡率降低,这些结果进一步说明EsTF、EsFe1和EsFe2可能在中华绒螯蟹应对螺原体的免疫防御机制中发挥了作用。