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研究目的和背景:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)简称肝癌,是全世界最常见的恶性肿瘤之一。虽然近年来肝癌的预防、诊断和治疗方法有了很大的改进,但其五年生存率仍不足50%,复发和转移仍是导致肝癌不良预后的主要原因。因此,探讨与肿瘤复发与转移相关因素,寻找预防和治疗的有效途径,提高病人的生存率,降低死亡率是目前肝癌研究的重点。近年大量的研究显示,某些lncRNAs的异常表达与人类肿瘤发生发展密切相关。Hippo激酶信号通路是一种高度保守的蛋白激酶链,在抑制肿瘤细胞增殖与转移中起关键作用,是近年来研究的热点。然而,Hippo激酶信号通路的上游lncRNAs调控因子仍不清楚,值得我们深入研究。研究方法:我们应用lncRNA microarray芯片从相同遗传背景、不同转移潜能两株肝癌细胞株HCCLM3和MHCC97L中筛选获得的差异性表达lncRNA uc.134。通过qRT-PCR结合组织原位杂交等技术验证其在肝癌组织及细胞中的表达情况,并结合临床随访资料进行统计分析,明确uc.134在肝癌组织中表达的临床意义;利用过表达、干扰及构建整体可视化动物模型等方法从体内外两个方面明确uc.134在肝癌中的作用;采用RNA pull-down结合质谱分析、RIP筛选鉴定uc.134特异性结合蛋白;应用mRNA芯片结合生物信息学方法、免疫共沉淀、免疫荧光共聚焦、Western bloting、泛素化检测等实验明确uc.134抑制肝癌发生发展的调控机制。结果:通过qRT-PCR、原位杂交、FISH等证实uc.134在肝癌细胞株中显著下调,且在原发肝癌组织中的表达水平与癌旁组织相比明显下调。通过结合临床随访资料分析uc.134在肝癌中的表达及其与各临床病理参数之间的关系,发现uc.134的表达水平与患者预后密切相关。我们运用5’Race及3’Race获得了uc.134转录本全长为1867bp,将全长序列定向克隆至pcDNA3.1载体中,构建了 uc.134过表达载体pcDNA3.1-uc.134。细胞功能学实验表明uc.134稳定过表达能抑制肝癌增殖、侵袭和转移。反之,稳定干扰uc.134,则得到相反的结果。为了进一步探讨uc.134在肝癌发生发展中的调控机制,我们应用RNA-pulldown结合质谱分析、RIP及WB实验筛选并验证了 E3泛素连接酶CUL4A等相互作用蛋白,并通过构建结构域突变载体结合免疫共沉淀、免疫荧光共聚焦、Western bloting 等实验阐明了 uc.134(1408-1867nt)绑定 CUL4A WHDD 结构域(592-759aa)并抑制其核输出。通过mRNA表达谱芯片分析、泛素化检测、qRT-PCR及Western bloting证实uc.134抑制CUL4A介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶LATS1蛋白的泛素化降解,从而激活Hippo激酶信号通路,促进YAP的磷酸化并抑制YAP下游靶基因的激活。我们进一步通过组织原位杂交及免疫组化在90例肝癌临床标本中验证了 uc.134、LATS1及pYAPS27在肿瘤中的表达明显下调,且其表达有显著正相关性。结论:我们的研究揭示一种新型lncRNA,uc.134通过抑制CUL4A介导的LATS1泛素化和增加YAPS127磷酸化从而激活Hippo信号网络,抑制YAP下游靶基因的激活,抑制肝细胞癌增殖和转移。我们的研究阐明了 uc.134抑制肝癌进展的新机制,并为肝癌的诊断标记物、预后分析和治疗提供了新的分子靶点。