胚胎干细胞的出现打开了生命科学研究领域一扇新的大门,小鼠胚胎干细胞系和人胚胎干细胞系的先后建立为干细胞转化医学的应用前景提供了无限的可能。但是人胚胎干细胞的发展面临着干细胞稳态在体外难以维持、现有的培养体系不够完善、分化变成体细胞效率低下以及分化机制不清楚等难题,为了实现干细胞的未来安全有效的转化,现急需解决这些问题。通过发掘以及解析特定基因在人胚胎干细胞中的功能及机制,是解决未来人胚胎干细胞多能性的体外维持、干细胞向特定谱系分化以及干细胞后续应用于临床治疗等的重要途径,对于早日实现干细胞的转化应用有着重要的意义。MTA家族蛋白(Metastasis-associated family protein)是一类转移相关蛋白,它的家族成员最先是从小鼠的乳腺癌细胞中发现的。MTA家族基因在多个的肿瘤细胞的增殖生长和侵袭转移过程中有着重要的调控作用,它们表达量的高低与癌症病人的存活率有一定的相关性。MTA家族基因包含有MTA1、MTA2和MTA3三个主要成员,虽然这三个基因具有同源性,但是它们在生理功能上有一定的差异;此外,还有研究发现MTA家族基因参与组成NURD(Nucleosome remodeling and histone deacetylation)复合物,从而发挥多样性的功能。近年来,MTA家族基因的功能在肿瘤细胞中被逐渐发现,清晰地认识和了解它们的调控机制有利于抗肿瘤药物的研制,对治愈癌症有积极的帮助。MTA基因功能的多样性在小鼠的胚胎干细胞稳态中的报道相对较多。我们实验室研究人员在前期也发现了MTA家族基因MTA1在小鼠胚胎干细胞多能性维持中发挥着重要的作用,但是MTA家族基因在人胚胎干细胞稳态维持中的作用还没有报道。虽然人和小鼠胚胎干细胞都是多能干细胞,但是它们在生物学特征方面却有很大的区别,比如体外培养条件不同以及基因表达谱存在差异等,所以本课题将重点研究MTA家族基因在维持人胚胎干细胞稳态方面的功能以及它们发挥功能的调控机制。首先,我们用PLKO.1慢病毒系统构建了针对人MTA三个基因的shRNA,包装出病毒后去侵染正常的人胚胎干细胞。干扰实验显示了:MTA1,MTA2和MTA3基因在人胚胎干细胞中的表达被成功下调。抑制MTA1基因的表达对人胚胎干细胞状态无影响,但是当MTA家族基因成员MTA2和MTA3的转录水平被抑制后,人胚胎干细胞原本的多能性稳态被破坏,表现为干细胞致密的克隆形态被破坏,细胞形态铺展开来,原本具有的碱性磷酸酶活性逐渐丢失,说明这些干细胞发生了分化。接着,基于以上实验表型,我们利用荧光定量PCR技术检测内、中、外三个胚层标志基因的表达情况,以确定MTA基因对人胚胎干细胞分化命运决定的影响。结果显示:相对于对照细胞,敲低MTA2或MTA3基因表达均会显著下调多能性基因NANOG和OCT4等多能性基因的转录水平。相反,敲低MTA2或MTA3基因的细胞株内中胚层(T,MIXL1,GSC)和内胚层(GATA4,GATA 6,SOX17,FOXA2)的标志基因基因表达上调,而外胚层的标志基因(NESTIN,OTX2,SOX1)未发生变化,表明基因MTA2和MTA3表达的缺失主要会诱导人胚胎干细胞向的中内胚层分化。同时我们也在人胚胎干细胞中分别上调表达了人MTA2和MTA3基因,但是在不添加外源性的自我更新维持因子Activin A和bFGF的条件下,并不能够维持人胚胎干细胞的未分化状态。以上结果说明了MTA2和MTA3基因对于人胚胎干细胞维持多能性的稳态是必要的。最后,我们通过添加不同激酶的小分子抑制剂,希望能够找出缺失MTA基因导致的人胚胎干细胞分化的分子机制。结果显示:小分子抑制剂ID8的加入处理能够有效地降低下调MTA2或MTA3表达的细胞株的分化速度和比例,碱性磷酸酶染色也显示添加ID8相比于未添加ID8组可以增加阳性克隆数,同时敲低MTA2或MTA3表达的细胞株中原本激活的中内胚层分化标志基因的表达也被ID8抑制。因为ID8是DYRK(Dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase)家族蛋白的抑制剂,此家族成员包括DYRK1A,DYRK1B,DYRK2,DYRK3和DYRK4,因此我们利用RNA干扰技术在MTA2或MTA3基因干扰的人胚胎干细胞株中分别将它们的表达下调。结果显示:虽然DYRK2可以抑制MTA2下调引起的人胚胎干细胞分化,但不影响MTA3干扰所导致的表型,但是抑制DYRK4基因可以同时阻止MTA2和MTA3缺失诱导的人胚胎干细胞分化,说明DYRK调控的信号可以介导MTA2和MTA3对人胚胎干细胞命运决定的调控。综上,我们的研究揭示了MTA调控人胚胎干细胞多能性稳态的作用,并揭示了它们作用的部分机理。研究结果丰富了人胚胎干细胞多能性的调控理论,深化了人们对干细胞的认识,有利于干细胞未来的基础和转化研究。