背景:乳腺癌是目前全球女性最常见的肿瘤之一,尽管过去几十年中乳腺癌的诊断和治疗技术不断发展,但仍然难以有效降低其晚期死亡率。近年来,对包括循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ct DNA)、循环micro RNAs和外泌体等在内的多种带有肿瘤分子特征的循环标记物的检测正在成为肿瘤早期诊断领域的研究热点。在各种循环标记物中,肿瘤细胞和micro RNAs分别在细胞和分子层次反映了肿瘤的生理病理特征,有望成为新型的生物标记物,为乳腺癌早期诊断和预后监测提供帮助。但是现有的肿瘤细胞和micro RNA检测方法还难以满足临床实际运用的需求,亟需探索一种新型的生物医学检测手段。太赫兹(Terahertz,THz)技术是一种快速无标记和非侵入式的光学检测方法,有望为上述肿瘤细胞和micro RNA的检测提供新思路。但是目前利用THz光谱技术检测肿瘤细胞和micro RNA分子还分别存在水敏感性和灵敏度两大技术难点:(1)水敏感性问题:当利用THz光谱检测细胞时,由于水分子对THz波的吸收十分强烈,细胞样本周围培养基层会对检测信号造成极大衰减,使得细胞的THz信号被培养基的背景信号所掩盖,导致活细胞的检测变的十分困难。考虑到人体来源的生物样本大多富含水分或者必须处于液相环境中,肿瘤细胞的THz波检测必须克服水敏感性问题对检测信号的干扰与湮没;(2)灵敏度问题:目前利用THz光谱可以在一定程度上进行核酸分子的定量检测,但是在不借助其他信号放大措施的情况下,单纯利用THz光谱检测核酸分子的灵敏度仅为纳摩尔级别,这种灵敏度目前还难以满足临床检测micro RNA的需求。由于乳腺癌特异性micro RNA分子本身在血液中的含量就极少,仅为血液样本中总RNA含量的0.01%左右,所以为了将THz光谱实际应用于micro RNA分子的检测,就必须寻找能够提高其检测灵敏度的方法。光透明剂(Optical clearing agent,OCA)是一类生物相容性好,光散射系数较低的有机溶剂。已报道OCA可以进入生物组织内部将生物组织间隙的水层置换出来,从而达到降低THz波在组织内信号衰减的效果,达到提高检测信号穿透深度的目的。这为利用光透明剂解决水敏感性问题提供了一些启示,但目前细胞层面的THz检测中将OCA直接用做活细胞的溶剂以降低水敏感性的尝试还未曾报道。因此寻找新的在THz频段OCA用于解决活细胞检测时的水敏感性问题成为本论文研究的主要方向之一。超材料是一种可以调节包括THz波在内的电磁波传播的新型亚波长人工合成材料。作为一种提高THz技术探测灵敏度的有吸引力的工具,超材料可以产生局部电场增强效应,从而探测到沉积在其表面的极少量物质。此外,由于超材料的频移随物质折射率的增加而增加,因此与高折射率粒子(如金纳米颗粒)结合的样品在超材料上很容易获得更强的THz响应。但是目前利用纳米颗粒增强THz超材料传感的机理尚未完全阐明,不同纳米颗粒对THz超材料生物传感器灵敏度的影响也尚未研究明确。因此将超材料技术和纳米颗粒技术系统结合并应用于THz光谱检测生物样本灵敏度的提高是本论文研究的另一个方向。综上所述,本研究开展了分别利用OCA技术和超材料技术解决水敏感性问题和灵敏度问题的理论基础、方法构建和实际应用研究,通过构建基于光透明剂和超材料的THz传感芯片进行肿瘤细胞和micro RNA分子的检测。在乳腺癌细胞检测部分的研究中,我们首先筛选出氟油作为解决THz光谱检测活细胞时水敏感性问题的OCA,并利用氟油置换了乳腺癌MDA-MB-231细胞外的培养基层。通过建立氟油环境中细胞样本THz吸收的二元模型,阐明了细胞在水相环境和氟油环境中THz信号差异的来源,为OCA技术用于乳腺癌细胞的THz光谱检测提供了理论支撑。随后我们将OCA技术和微流体传感技术结合,构建了一种THz微流体芯片,并通过检测抗肿瘤药物作用后乳腺癌细胞,验证了其定量检测细胞活性的可行性,构建了一种快速无标记无损伤的细胞活性检测方法。我们还利用液滴微流体技术成功实现了细胞悬液在OCA中的均匀分散,构建了一种将肿瘤细胞悬液制作成“细胞微滴”进行THz光谱检测的新模式。在乳腺癌特异性micro RNA分子检测部分的研究中,我们开展了结合超材料技术、纳米材料技术和链置换扩增技术的micro RNA-21检测研究,解决了传统THz光谱测量模式下灵敏度不足的问题。通过进行纳米颗粒和SDA产物结合方式研究,以及不同材料,不同规格的纳米颗粒对THz超材料检测信号响应的模拟和实验测量,我们筛选出具有最佳信号响应参数的纳米颗粒。在此基础上,我们构建并优化了一种集成超材料技术、纳米材料技术和SDA技术的THz超材料纳米芯片,获取了其检测micro RNA-21的灵敏度、特异性和重复性等一系列重要方法学指标并进行了临床样本检测研究。通过上述工作,本研究总结出解决THz光谱检测肿瘤细胞和micro RNA分子时所遇到的水敏感性问题和灵敏度问题的方法,所构建的THz微流体芯片和THz超材料纳米芯片可分别用于乳腺癌细胞活性定量检测和乳腺癌特异性micro RNA分子高灵敏检测,为乳腺癌循环标记物研究提供了有效的技术手段。方法:1.适用于乳腺癌细胞THz检测的OCA筛选:选取9种常见有机溶剂,采用CCK-8法检测其与乳腺癌MDA-MB-231细胞作用后的细胞存活率评价其细胞毒性。采用THz光谱测量候选OCA的吸收系数和折射率并和DMEM培养基比较评价其THz吸收情况,综合细胞毒性和THz吸收情况筛选最佳OCA。2.OCA置换乳腺癌细胞外水层的方法:将乳腺癌MDA-MB-231细胞培养在PE片上制作细胞爬片样本,将其装入液体样本检测池后采用注射器吸取OCA冲刷PE片的方法进行细胞外水层的置换,对置换前后培养基环境和OCA环环境中的乳腺癌细胞进行THz光谱检测。3.基于OCA的THz微流体传感芯片的构建与应用:设计加工COP材料的基于OCA的THz微流体传感芯片,利用芯片内部的密闭空间实现了样本层厚度的精确控制和细胞外水层的完全置换,开展THz微流体芯片检测抗肿瘤药物作用后乳腺癌细胞的检测研究,通过将检测结果与传统的流式细胞仪方法对比,验证了THz微流体芯片定量检测细胞活性的可行性。4.THz液滴微流体芯片的构建与应用:设计加工PDMS材料的液滴微流体芯片,通过控制进入芯片的OCA和肿瘤细胞悬液的流速比,稳定产生均一的直径50μm的OCA包裹肿瘤细胞悬液结构微液滴,进行悬浮肿瘤细胞的THz光谱检测研究。5.用于micro RNA分子检测的THz超材料传感体系构建:设计具有特异性识别位点的单链DNA探针,构建了micro RNA-21分子的SDA反应体系,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法验证体系构建的有效性。设计和制备了用于micro RNA-21的SDA产物检测的超材料亚波长谐振单元,利用紫外可见吸收光谱、透射电镜和Zeta电位测量等方式,验证产物制备的有效性。6.纳米颗粒对THz超材料信号增强效果研究:开展纳米颗粒和SDA产物结合方式研究,以及不同材料,不同规格的纳米颗粒对THz超材料检测信号响应的模拟和实验测量,基于纳米颗粒和micro RNA分子SDA产物复合物在超材料上的信号响应,筛选具有最佳信号增强效果的纳米颗粒。7.THz超材料纳米传感芯片的构建和性能表征:在前期THz超材料传感体系的基础上优化其各项检测条件,完成THz超材料纳米传感芯片的构建,并对该芯片检测micro RNA-21分子的灵敏度、特异性和重复性等方法学参数进行表征。8.THz超材料纳米传感芯片的临床价值评估:开展了THz超材料纳米芯片检测临床血清样本中micro RNA-21分子的回收率实验,验证了其应用于实际样本检测中的效果。结果:1.和氟油作用60min后,乳腺癌细胞的存活率仍然可以保持在85%以上,明显好于其他候选OCA,氟油在室温下1 THz处的吸收系数为10 cm-1左右,仅为DMEM的1/25左右。根据细胞毒性和在THz频段的吸收情况等参数,筛选出氟油作为适用于活细胞THz光谱检测最佳OCA。采用氟油置换乳腺癌细胞周围水层后,原本DMEM培养基环境中难以检测的细胞信号得以显现,证实了氟油降低THz波信号衰减,排除水敏感性的可行性。建立氟油环境中细胞样本THz吸收的二元模型,阐明了细胞在水相环境和氟油环境中THz信号差异的来源。2.利用THz微流体芯片内部的密闭空间实现了样本层厚度的精确控制和细胞外水层的完全置换后,氟油环境中含细胞时的THz时域波形和纯氟油环境相比出现明显差异。独立样本t检验的结果表明,氟油环境中有细胞和无细胞之间存在统计学上的显著差异(0.5、1.0和1.5 THz处的P<0.05),而DMEM环境中有无细胞时没有观察到统计学上的显著差异(0.5、1.0和1.5 THz处的P>0.05)3.不同浓度的顺铂和紫杉醇作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞后,细胞样本的THz归一化振幅随药物浓度的增加而逐渐降低,在1 THz处的THz归一化振幅相对改变值和流式细胞仪测得的细胞存活率呈现明显的线性关系(顺铂:y=0.99x-1.21,R2=0.98;紫杉醇:y=0.96x-0.13,R2=0.96)。4.液滴微流体芯片中当两相流速比为0.6,微通道直径50μm时,可稳定产生直径为50μm,体积为250 pl的微液滴用于包裹肿瘤细胞悬液。当所用细胞悬液浓度的增大,液滴中细胞的数量也在不断增长,其在1 THz处的功率值也不断增大。5.SDA反应体系的PAGE分析结果表明,SDA产物在凝胶上的位置和与合成的产物DNA位置相同,证明了所设计的SDA体系对micro RNA-21分子扩增的有效性。TEM结果显示SDA产物和纳米颗粒结合后可以被MBs有效捕获,捕获后的磁珠Zeta电位(-32.00±0.36 m V)明显低于空白MBs(-28.97±0.17 m V)。不同直径、不同材质纳米颗粒对THz超材料信号方法的效果研究显示,在直径相同的情况下,Au NPs比Ag NPs能产生更大的超材料共振峰频移量。材质相同的情况下,50 nm直径的纳米颗粒可产生比其他直径更大的超材料共振峰频移量。以上结果表明了用于micro RNA分子检测的THz超材料传感体系构建的有效性。6.构建了THz超材料纳米芯片,验证其检测micro RNA-21的有效性。空白超材料的共振峰的位置大约为0.75 THz处,当超材料上沉积有样本时,其共振峰开始向低频方向移动。“micro RNA分子SDA产物-Au NPs”复合物在超材料上的共振峰频移量是结合Au NPs的micro RNA分子SDA产物的2倍。所构建的THz超材料纳米芯片优化后的传感条件如下:Klenow片段聚合酶浓度为200 U/m L、Nt.Bsm AI缺口核酸内切酶浓度为200 U/m L、SDA反应时间为2h、纳米探针的浓度为50μg/m L、生物素探针浓度为100μM、纳米探针、触发DNA和生物素探针的杂交时间为60 min。7.micro RNA-21分子浓度和其在THz超材料纳米芯片上的信号响应存在明显的线性关系,线性回归方程表示为?=3.04+13.37(=0.9985),检出限(LOD)为14.54 a M,线性范围为1 f M-10 p M。micro RNA-21样品的?显著高于单碱基突变micro RNA-21、双碱基突变micro RNA-21、完全错配序列、micro RNA-25、micro RNA-139a和Mix A(micro RNA-25和micro RNA-139a混合物)(P<0.05),2种干扰micro RNA和Mix A的DI值均低于10%(micro RNA-25为6.17%,micro RNA-139a为3.46%,Mix A为5.16%)。THz超材料纳米芯片检测1 p M浓度的micro RNA-21分子的RSD为2.91%。以上结果说明THz超材料纳米芯片检测micro RNA分子具有良好的灵敏度、特异性和重复性。8.利用THz超材料纳米芯片检测带有10p M、1p M、100f M和10f M浓度micro RNA-21分子的临床血清样本,所制备的血清样品的RSD在2.31%-4.77%之间,回收率在90.92%-107.01%之间,说明所设计的THz超材料纳米芯片具有良好的性能可在实际样品中对靶micro RNA分子进行有效检测。结论:1.低THz吸收和低细胞毒性的氟油可降低THz检测信号在穿过细胞样本时的信号损失,提高输出THz波检测信号的强度,有效降低细胞液相检测时的水敏感性。所建立的氟油环境中细胞样本THz吸收的二元模型,阐明了细胞在水相环境和氟油环境中THz信号差异的来源,为OCA技术用于乳腺癌细胞的THz光谱检测提供了理论支撑。所提出的OCA置换细胞外水层的方法不仅可以有效的降低THz技术检测细胞样本时的背景干扰,还能最大程度的保持细胞活性和形态学的完整性,有助于获取细胞正常生理状态下的真实信息。2.所构建的基于OCA的THz微流体传感芯片可有效控制乳腺癌细胞样本层厚度,可对细胞外水层进行完全置换。利用该传感芯片构建了一种新型细胞活性检测方法,可对抗肿瘤药物作用后的细胞活性进行定量检测,一次有效检测所需细胞数量仅为3600个细胞左右。和传统细胞活性检测方法相比,该THz微流体传感芯片具有快速检测、无需标记和安全无损的特点,有望为临床药物筛选提供新的研究工具。利用液滴微流体技术成功实现了细胞悬液在OCA中的均匀分散,构建了一种将肿瘤细胞悬液制作成“细胞微滴”进行THz光谱检测的新模式,进一步拓展OCA技术在THz光谱检测细胞领域的应用范围。3.开展了纳米颗粒和SDA产物结合方式研究,以及不同材料,不同规格的纳米颗粒对THz超材料检测信号响应的模拟和实验测量。筛选出在超材料上具有最佳信号响应参数的纳米颗粒,阐明了不同材料,不同规格的纳米颗粒在超材料上信号响应的原理和改变因素,为利用纳米材料增强THz超材料信号提供了理论基础。在此基础上构建出一套系统的集成超材料技术、纳米材料技术和SDA技术的micro RNA-21传感体系,解决了传统THz光谱测量模式下灵敏度不足的问题,为微量micro RNA分子的检测提供有效技术手段。4.构建了一种集成超材料技术、纳米材料技术和SDA技术的THz超材料纳米芯片,获取了其检测micro RNA-21的灵敏度、特异性和重复性等一系列重要方法学指标。开展了THz超材料纳米芯片检测临床血清样本中micro RNA-21分子的回收率实验,验证了其应用于实际样本检测中的效果。和现有电化学和光学传感器检测方法相比,所构建的THz超材料纳米芯片在保持同一级别检测性能的同时具有易获得、简单实现和低成本等优点,有望为核酸分子和肿瘤诊断研究提供了一个有前景的分析平台。