马铃薯Y病毒侵染对烟草类乳胶蛋白泛素化的调控研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:momoko120
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在寄主与病毒协同进化中,寄主植物采用多种策略来应对病毒侵染,涉及不同细胞受体和信号通路之间复杂但严格调节的相互作用网络,其特异性和复杂性还取决于参与免疫应答的起始、维持和终止的蛋白质的翻译后修饰。其中泛素/26S蛋白酶体系统(ubiquitin/26S proteasome system,UPS)几乎都参与了植物防御机制的每个步骤,不仅是植物用来抵抗侵染的武器,还是某些病原体利用的目标,这些病原体已经进化出抑制和/或使用该系统以达到其自身目的的机制。本研究以经济作物为害严重的马铃薯Y病毒(Potato Virus Y,PVY)和本氏烟为主要研究材料,基于蛋白质组学和泛素化蛋白质组学的综合分析,确定寄主植物中响应PVY侵染胁迫的相关差异蛋白,及其泛素化蛋白,继而利用泛素化位点突变和Pull-down技术,验证了PVY侵染促进类乳胶蛋白43(MLP-like protein 43,NbMLP43)的泛素化而有利于自身侵染,以期为研究植物病毒的致病机理和植物抗病毒机制提供理论依据。本研究取得以下研究结果:1.PVY侵染本氏烟后蛋白质组学与泛素化组学分析基于赖氨酸泛素化肽段富集技术和LC-MS/MS技术,对PVY侵染后本氏烟在蛋白组水平上和泛素化水平上分别进行了蛋白和蛋白泛素化水平差异分析、GO富集分析、KEGG和亚细胞定位分析。蛋白质组学数据显示,在PVY侵染后4 d,有67种蛋白上调,有50种蛋白下调。通过GO富集和KEGG富集分析发现,在病毒与寄主互作中,响应胁迫和激素信号转导通路蛋白上调,其中MLP-like protein 28在蛋白水平上表达上调。泛素化蛋白质组学结果显示差异显著的泛素化蛋白共31种,其中12种蛋白的泛素化水平上调,19种蛋白的泛素化水平下调,其中MLP-like protein 43泛素化水平上调、蛋白水平表达下调。验证试验表明,PVY侵染引起寄主泛素化水平上调,在3-5 d时泛素化水平最高。用蛋白酶抑制剂MG132进行的处理结果显示,PVY在基因和蛋白水平上均显著降低,由此推定寄主的泛素化有利于病毒的侵染。2.MLP-like protein 28(NbMLP28)对PVY侵染胁迫的响应分析首次鉴定了本氏烟中的MLP-like protein 28(称为NbMLP28),并对其进行了功能分析。本研究从本氏烟中克隆获得NbMLP28 CDS序列(GenBank登录号MK780769)。NbMLP28定位于质膜和细胞核,在根中含量最高。NbMLP28基因被推定为由PVY侵染触发,并在茉莉酸(JA)信号传导途径中高表达,PVY侵染2d时NbMLP28达到表达高峰。通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)和瞬时过表达试验验证了NbMLP28响应PVY侵染胁迫的功能。克隆并分析了该基因的启动子,经分析含有响应MeJA、光照、干旱、植物激素等的顺式作用元件,以期获得受胁迫诱导的特异表达的转录因子。3.MLP-like protein 43(NbMLP43)对PVY侵染胁迫的响应分析从本氏烟中通过同源克隆首次获得NbMLP43 CDS序列(GenBank登录号MK780770),序列比对表明本氏烟中NbMLP43与棉花上MLP28亲缘关系最近。进一步扩增了烟草上NbMLP43的启动子序列,经生物信息学分析表明其启动子序列中含有响应SA、光照、温度、胁迫等的顺式作用元件。通过构建携带RFP标签和激光共聚焦技术,观察NbMLP43蛋白主要定位在细胞质和细胞核。NbMLP43在本氏烟叶部表达量最高。表达模式分析了该基因对PVY胁迫的响应,PVY侵染3 d时NbMLP43达到表达高峰。通过CRISPR和组成型过表达进一步验证了该基因响应PVY胁迫的功能,结果表明敲除NbMLP43抑制了PVY的侵染,活性氧染色和酶活测定结果表明NbMLP43可能与CAT活性和下游活性氧的清除有关,NbMLP43的过表达抑制了PVY对本氏烟的侵染。通过激素喷施和沉默激素通路关键基因,鉴定了调节本氏烟中NbMLP43表达的途径,NbMLP43响应SA信号转导通路。另外,过表达NbMLP43转基因本氏烟转录组学也均富集到SA通路基因的表达上调。4.NbMLP43的泛素化对PVY侵染的影响研究基于蛋白质组和泛素化蛋白质组学分析,鉴定到NbMLP43在蛋白水平下调,而泛素化水平上调,鉴定到泛素化肽段是SNPHQTSTMSPDK(1)IK。为进一步明确NbMLP43的泛素化位点,构建携带RFP标签的转基因烟草,利用pull-down技术纯化获得携带RFP标签的NbMLP43,通过LC-MS/MS技术,鉴定到PVY侵染后NbMLP43的泛素化位点也是K38。利用泛素化抗体验证了PVY侵染引起NbMLP43的泛素化水平上调。通过点突变技术,将K38突变为R38。点突变后的PVY侵染试验表明,NbMLP43泛素化水平下调,同时病毒在基因和蛋白水平上均表达下调,由此推定,PVY利用NbMLP43的泛素化从而有利于自身侵染。然而,详细的分子机理有待于进一步研究。
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