胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是由于各种原因使胰岛素在周围组织摄取和清除葡萄糖的效率下降，机体代偿性的分泌过多的胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。肥胖可以导致IR的发生，而IR又是肥胖症、高血压病、血脂代谢异常等代谢综合征的共同危险因素。因此，胰岛素抵抗一直是内分泌的研究热点。胰岛素抵抗和肥胖已经成为一个世界性的问题，导致内分泌和代谢的改变，包括男性性腺功能减退。性腺功能减退常发生在肥胖的人，伴有睾酮水平的减低。肥胖常伴有性激素浓度的改变。低浓度的睾酮与腹型肥胖和代谢综合征有关，同时，患心血管疾病的危险性也增加。美国马塞诸塞州的一项有关男性的研究中，肥胖病人的游离和总睾酮都低于正常人。腹型肥胖使胰岛素和C-肽水平升高，而胰岛素和C-肽水平与总睾酮和游离睾酮呈负相关。　　下丘脑脉冲式分泌促性腺激素释放激素(GnRH)调节垂体黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的释放。LH调节睾丸间质细胞睾酮的生物合成，LH的分泌受睾酮和雌激素的负反馈调节。而FSH主要是与支持细胞上的FSH受体结合调节生精过程。FSH的分泌受活化素和抑制素的调节。除了垂体促性腺激素调节睾酮的生物合成，许多的因子也调节其分泌和合成，比如增食欲素A(Orexin A)。　　OrexinA和增食欲素B(Orexin B)是涉及到饮食、能量稳态、睡眠周期、奖赏、动脉血压和心率、自主神经系统和许多内分泌轴调节的下丘脑神经肽。他们通过G蛋白偶联受体增食欲素受体1(OX1R)和增食欲素受体2(OX2R)在中枢神经系统和外周组织发挥其生物学作用。增食欲素(orexins)在中枢水平调节GnRH分泌，orexin A和B在类固醇存在的条件下刺激LH的分泌，而在卵巢切除大鼠无类固醇的条件下抑制LH分泌，说明orexins在中枢对LH的调节有双向性。除了青春期前期大鼠睾丸几乎不表达前增食欲素原(PPO) mRNA，从出生到成年后均有PPO mRNA的表达，说明大鼠睾丸表达的PPO mRNA可能是年龄依赖性。成年后大鼠睾丸曲精细管和间质均表达orexinA，但是曲精细管可能是orexinA表达的主要部位。成年大鼠睾丸的免疫学研究发现:orexinA的免疫性在成年大鼠生精细胞减数分裂的特定时期也有表达，表明orexinA可能参与了大鼠生精周期调节。成年后大鼠睾丸也表达orexin A的受体OX1R。OX1R mRNA的有存在着发育阶段性。在大鼠的体内研究中，证实了睾丸间质细胞不是OX1R mRNA表达的主要来源，同时，并没有检测到OX2R mRNA的表达。除了大鼠睾丸表达OX1R，在人类、羊和鸡的睾丸也检测到OX1R和OX2R的表达。OX1R也在人类睾丸的间质细胞、管周肌样细胞和支持细胞表达。因此orexins及其受体可能参与到生殖系统功能的调节。近来的研究证实了:在培养的癌症细胞中，orexins能诱导细胞的凋亡，降低种植在小鼠身上人类结肠癌细胞的生长，而在正常的结肠上皮细胞，orexins却没有这种作用。　　3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)是类固醇代谢的关键酶，使孕烯醇酮转化为孕酮，许多器官都表达3β-HSD，3β-HSD是睾丸间质细胞产生睾酮的组织化学标志。许多生长因子、类固醇和细胞因子通过多种途径调节3β-HSD的表达。在人类H295R肾上腺皮质细胞中，orexinA能够刺激类固醇生成和3β-HSD的表达。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，orexinA刺激的OX1R表达和p38裂素原活化蛋白酶(MAPK)的磷酸化。而原代提取的睾丸间质细胞中，orexinA通过何种途径，是否刺激睾酮分泌还不清楚。　　本研究通过高脂饮食喂养建立胰岛素抵抗肥胖大鼠模型，应用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验证实模型的建立，观察血浆orexinA的变化及OX1R在睾丸组织的表达情况;orexinA对睾丸间质细胞增殖的影响;orexinA及其受体OX1R对睾丸间质细胞3β-HSD表达及睾酮分泌调节，探讨orexinA及其受体OX1R对睾丸间质细胞3β-HSD表达及睾酮分泌调节的分子机制研究。　　实验方法：　　第一部分、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠睾丸组织中的表达研究　　选择8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，随机分为2组:正常对照组和高脂饮食组(HF)。对照组予以普通颗粒饲料，高脂组予以高脂饲料。饲养8周后，每组随机选取5只进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验验证胰岛素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心脏取血，分别进行血糖、血脂、胰岛素、LH、FSH、睾酮和orexinA水平测定。处死大鼠后，留取睾丸组织，应用免疫组化检测睾丸组织OX1R定位表达，western-blot技术检测睾丸组织OX1R蛋白表达。　　第二部分、Orexin A对3β-HSD的表达及睾丸间质细胞增殖的影响　　原代提取大鼠睾丸间质细胞，用浓度梯度orexin A和OX1R特异性抑制剂(SB334867)进行干预， MTT法检测细胞增殖，凋亡试剂盒检测细胞凋亡，实时定量PCR检测3β-HSD mRNA的表达情况。　　第三部分、OrexinA及OX1R干预睾丸间质细胞睾酮分泌的分子机制研究　　原代提取大鼠睾丸间质细胞后，western-blot检测orexin A对OX1R、ERK、p38、JNK MAPKs和3β-HSD蛋白水平的影响，RT-PCR方法检测orexin A对OX1RmRNA、OX2R mRNA和3β-HSD mRNA水平的影响，RIA检测睾酮水平。　　实验结果：　　第一部分、OrexinA及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠睾丸组织中的表达研究　　（一） IR大鼠体重和血浆中血糖、血脂、FSH、LH、睾酮和orexinA水平　　HF组大鼠体重、血清TG、TC、LDL-C均显著高于对照组，而HDL-C较对照组无统计学意义;HF组血清FSH、LH、睾酮和orexin A水平均低于对照组。　　（二）免疫组化和western blot分析各组大鼠睾丸组织OX1R的表达　　免疫组化结果显示:大鼠睾丸间质细胞有OX1R免疫阳性表达，HF组睾丸组织中OX1R阳性染色颗粒较对照组明显减少。Western-blot结果显示:HF组大鼠睾丸组织OX1R蛋白表达较对照组明显减少。　　第二部分、Orexin A对3β-HSD的表达及睾丸间质细胞增殖的影响　　（一）Orexin A对原代睾丸间质细胞增殖和凋亡的影响　　浓度梯度orexinA可促进间质细胞增殖，加入OX1R特异性抑制剂可抑制这种增殖作用。10-6M和10-8 M orexin A减少间质细胞凋亡，而10-10M orexin A无这样的作用，OX1R特异性抑制剂可抑制orexin A对睾丸间质细胞凋亡的影响。　　（二） OrexinA对3β-HSD mRNA水平的影响　　Orexin A能诱导3β-HSD mRNA水平的增高，OX1R特异性抑制剂可抑制这种作用。　　第三部分Orexin A及OX1R干预睾丸间质细胞睾酮分泌的分子机制研究　　（一） Orexin A对原代睾丸间质细胞中OX1R的表达的影响　　本研究结果显示，OX1R mRNA在原代睾丸间质细胞中表达，而无OX2RmRNA的表达。Orexin A能剂量依赖性的从基因和蛋白水平刺激其受体OX1R的表达。10-6 M、10-8M和10-10M orexin A均能增加OX1R mRNA水平，10-6MorexinA对其受体的影响最大;10-6M和10-8M orexin A在蛋白水平上上调其受体水平，10-6 M orexin A的影响最大，而10-10M orexin A对其受体刺激影响无统计学意义。　　（二） OrexinA对ERK、p38和JNK MAPKs蛋白水平的影响　　本研究用蛋白印迹方法测定orexin A对ERK1/2和p38 MAPKs的影响。OrexinA能诱导ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化，而分别用U0126和SB203580预处理后，能阻滞这种作用。但是，orexinA对JNK MAPK的磷酸化水平影响无统计学意义。　　用10-6M orexin A处理的原代睾丸间质细胞，在5、10和30min均能增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平，而在60min未见明显差异，10min的表达最高。10-6MorexinA在处理间质细胞5、10、20和30min均能刺激p38 MPAK的磷酸化，10min的表达最高。SB334867预处理能够阻滞10-6 M orexinA对ERK和p38蛋白的影响　　（三） Orexin A对3β-HSD和睾酮水平的影响　　10-6M orexinA能刺激3β-HSD蛋白和基因水平上的mRNA表达增多。同时，培养基中睾酮水平也增加。U0126、SB203580或分别和SB334867联合阻滞均能一应程度上抑制orexinA作用。　　结论：　　1、胰岛素抵抗肥胖大鼠体内血浆orexin A水平降低，其受体OX1R在睾丸间质细胞胞浆中表达，且其表达量在IR大鼠睾丸中降低，提示除了中枢系统外，orexin A可能作为一种循环激素通过自分泌或者/和旁分泌作用参与能量平衡和睾丸间质细胞功能的调节。　　2、Orexin A在原代提取的睾丸间质细胞中，能够刺激原代提取的睾丸间质细胞细胞的增殖和抑制凋亡的发生。　　3、在原代提取的睾丸间质细胞中，orexinA通过上调其受体的活性而发挥其生物学作用。　　4、Orexin A通过受体介导的ERK1/2和p38 MAPKs激活刺激睾丸间质细胞中3β-HSD表达及其活性增强，并且促进睾酮生成，提示orexin A可能是调节睾酮合成过程中的重要调节因子。