【摘 要】
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在苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）应用研究上,主要利用基因工程技术来构建更高毒力的重组蛋白和重组菌株,如定点突变研究,融合基因研究,转基因植物研究等方面
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在苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）应用研究上,主要利用基因工程技术来构建更高毒力的重组蛋白和重组菌株,如定点突变研究,融合基因研究,转基因植物研究等方面的研究。为了构建更高毒力,杀虫谱更广的工程菌株,本研究利用crylAc基因和神经毒素基因hwtx-Ⅰ构建融合基因来提高晶体蛋白的杀虫毒力。 采用生物信息学方法比较crylAc基因序列的同源性,通过设计引物对Ac-F和Ac-R从Bt4.0718菌株质粒上扩增含有上游启动序列的crylAc基因的片段,然后用Bt菌株偏爱密码子优化设计虎纹毒素-Ⅰ基因（hwtx-Ⅰ）和肠激酶位点序列（Enterokinase site简称ErK site）,然后进行化学合成。对合成片段进行磷酸化退火连接,设计引物对Ltx-F和Ltx-R扩增完整的hwtx-Ⅰ和ErK site的片段。然后将这两个片段进行连接,用引物对Ac-F和Ltx-R扩增出融合基因片段,经一系列酶切和亚克隆,将带有上游启动序列和下游终止序列的融合基因片段克隆进穿梭载体pHT304中,获得表达载体pXL43。将表达载体pXL43分别电转化进无晶体突变株XBU001获得重组菌株XL002和野生型菌株Bt4.0718中获得重组菌株XL004。 经SDS-PAGE分析:融合基因在无晶体突变株中得到大量表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白占总蛋白量的61.38%。将重组菌株XL002经发酵并纯化重组晶体蛋白,经原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）观察显示:融合晶体蛋白呈有规则的菱型晶体,其大小约为1.0×2.0μm。生测结果显示:融合晶体对小菜蛾（Plutella xylostella）有高效杀虫活性,生测2d的Lc50值为5.12μg/ml。从融合晶体中提取20kb-DNA,并进行PCR鉴定,进一步证明晶体中20-kbDNA片段部分来自于质粒。还对重组菌株XL004进行了SDS-PAGE和生测分析,并对融合基因在重组菌株中表达进行了探讨。本研究通过成功构建crylAc基因和hwtx-Ⅰ基因的融合基因,为构建Btcry基因和其它外源毒素基因的融合基因以及构建高毒力的工程菌株奠定
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