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目的：
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一组全身性的骨骼疾病,其特征是骨量减少或(和)骨组织微结构破坏,从而导致骨强度下降,骨脆性增加,最终导致骨折的发生。OP发生的根本原因是骨吸收速度超过骨形成。而破骨细胞(osteoclasts,Ocs)在骨吸收过程中起着关键性作用。
Ocs来源于单核/巨噬细胞谱系中的定向造血干细胞,该类细胞在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和细胞核因子κB活化因子配体(nuclear factor κ B activation factor ligand,RANKL)的作用下逐渐分化为成熟OCs。成熟Ocs通过分泌多种金属基质蛋白酶(matrix matalloproteinases,MMPs)降解骨基质而发挥其骨吸收功能。而在MMPs中,MMP-2,3,7,9,13可能具有重要作用。
CD4+CD25+调节性T细胞是一种具有高度抑制功能的T细胞,是维持免疫系统稳态的主要作用细胞。根据对已有文献的理解,我们认为,Ocs与CD4+CD25+调节性T细胞之间应该具有必然的联系。首先,OCs来源于单核/巨噬细胞,其本质上归属于抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,APC),而作为T细胞的CD4+CD25+调节性T细胞对OCs理论上应该具有调节作用;其次,多个文献报告,在多种免疫疾病中,如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)及炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等患者常伴随明显的骨质疏松,而该类患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的数目则有所下降。
基于以上理解,我们研究了小鼠CIM+CD25+调节性T细胞对OCs分化及其分泌MMPs的影响,旨在从免疫学的角度说明骨质疏松发生的一方面机制。
方法：
1、免疫磁珠法(magnetic cell sorting,MACS)分选细胞
利用MACS方法分别从小鼠脾脏及骨髓中分选出CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-T细胞和CD11b+细胞。利用相应荧光抗体标记后,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞纯度。将细胞置于适宜环境中分别培养。
2、T细胞与CD11b+细胞共培养
CD11b+细胞在含有M-CSF、RANKL和骨片的培养体系中单独培养3天后,分别与CD3抗体激活的CD4+CD25+调节性T细胞或CD4+CD25-T细胞按照相应比例共培养4天。
3、CD4+CD25+调节性T细胞对OCs分化的作用
共培养4天后,进行酒石酸酸性磷酸酶(tartrate acid phosphate,TRAP)染色,观察OCs形态,同时计数OCs数目;对骨片进行甲苯胺蓝染色,观察吸收陷窝的形态,计数吸收陷窝数目并测量吸收面积。
4、CD4+CD25+调节性T细胞对OCs分泌MMPs的作用
共培养2天后,利用酶联免疫分析的(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测培养上清中MMP-2,3,7,9的含量。
结果：
1、MACS分选细胞纯度
根据流式结果,利用MACS方法分离得到的CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-T细胞和CD11b+细胞的纯度均在90%以上。
2、CD4+CD25+调节性T细胞对Ocs分化的作用
(1)TRAP染色的结果显示,与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+调节性T细胞能显著抑制OCs的生成(p＜0.01)。
(2)甲苯胺蓝染色的结果显示,与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+调节性T细胞能显著抑制Ocs吸收陷窝的形成,并能显著减少吸收面积(p＜0.01)。
3、CD4+CD25+调节性T细胞对OCs分泌MMPs的作用
ELISA检测的结果显示,与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+调节性T细胞显著减少共培养上清中MMP-7和MMP-9的含量(p＜0.01),但对MMP-2和MMP-3则无显著作用。
结论：
CD4+CD25+T细胞显著抑制OCs分化及其骨吸收功能,并显著抑制OCs分泌MMP-7和MMP-9。