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microRNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA，通常为21～25个核苷酸，可与其靶基因的3-非翻译区互补配对，激活核蛋白复合体miRNAP，对靶mRNA进行切割或翻译抑制，从而参与调控基因表达。miRNA广泛存在于动植物细胞中，与肿瘤关系密切。多数已知的miRNA位于基因组中与肿瘤相关的区域，某些组织特异性miRNA表达图谱的改变可见于直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、垂体瘤等多种肿瘤。
肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，Takamizawa等发现肺癌患者的let-7表达显著降低，并且let-7表达水平越低，预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人肺癌细胞中瞬时表达let-7可以抑制细胞的增殖。let-7在肺癌的发生发展中作为一个抑癌基因在发挥作用。let-7a2是这个家族的成员之一，其基因定位于染色体11q24.1。
1，25一二羟维生素D3(1，25-(OH)2D3)是维生素D的体内活性形式，能够调节细胞的分化增殖，而这种作用是通过维生素D受体(VDR)介导发挥其生物学效应的。人类VDR基因位于染色体12q13.11，基因全长约4669bp。VDR蛋白为配体依赖性转泵因子，1，25-(OH)2D3通过激活VDR，进而形成VDR/RXR/辅转录因子复合体，与靶基因启动子区域的VDR应答元件(VDRE)识别结合，影响RNA聚合酶II介导的某些基因转录，影响细胞的生长、分化、凋亡等过程。l，25-(OH)2D3可降低肺癌细胞系的生长，促进细胞凋亡。VDR属于核转录因子，在肺癌组织中VDR mRNA的表达下调。VDR表达和功能的改变可能导致细胞对l，25-(OH)2D3的反应性变化，而改变对细胞的生长、分化、凋亡等过程的调控。
let-7a2在肺癌中作用及表达调控的机制尚未见研究报道，并且在研究let-7a2表达调控时发现，l，25-(OH)2 D3可在转录水平上调let-7a2在肺癌细胞A549中的表达，其调控机制及其在肺癌中的作用很有必要进行深入研究。本课题在基因启动子及转录水平研究1，25-(OH）2D3在肺癌中对let-7a2基因表达的调控作用，并初步探讨其调控机制。在此研究中，(1)首先利用5.RACE寻找到let-7a2基因5‘上游的转录起始点，进一步通过PCR扩增其5‘上游包含启动子的2.8 kb片段(+336bp至-2523bp)，构建let-7a2的2.8kb启动子.荧光素酶报道基因质粒并检测其在肺癌A549细胞中的启动子活性。(2)A549细胞经过9-顺维甲酸(9-cis-RA)、全反式维甲酸(AT-RA)、氯化锂(LiCl)、地塞米松(Dex)、1，25-(OH)2D3处理或者分别转染let-7a2启动子-荧光素酶报道基因质粒和let-7a2靶序列-报道基因融合质粒后，经9-cis-RA、AT-RA、LiC1、Dex、1，25-(OH)2D3处理48 h后，分别通过RT-PCR和荧光素酶活性检测，观察它们对let-7a2在A549细胞中表达的影响。(3)通过构建let-7a2基因5，上游VDR反应元件(VDRE)-绿色荧光蛋白报道基因质粒，转染A549细胞并经1,25-(OH)2 D3处理后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，了解1，25-(OH)2 D3激活VDR转录因子并与VDRE结合，促进报告基因表达的作用。(4)通过电泳迁移率改变实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀分析(CHIP)，检测在1，25-(OH)2D3作用下VDR与VDRE的结合活性。(5)收集18组临床肺癌标本，用RT-PCR方法检测let-7a2和VDR在肺癌组织中表达的相关性。(6)构建let-7a2真核表达质粒，并检测其在肺癌细胞A549中的表达及对A549细胞增殖凋亡的影响。
结果：(1)通过5’RACE，确定了let-7a2的转录起始点，并克隆了let-7a2基因5’上游2.8kb启动子片段，成功构建了let-7a2启动子-荧光素酶报告基因质粒，并且在肺癌细胞A549中显示有启动子活性。(2)9-cis-RA、AT-RA和1，25-(OH)2D3能够增强let-Ta2在肺癌细胞中的表达；而LiCI和转录因子CEBPα则使let-7a2在肺癌细胞中的表达降低。(3)1，25-(OH)2D3能够增强VDRE-绿色荧光蛋白报道基因质粒中绿色荧光蛋白的表达，表明1，25-(OH)2D3能促进VDR与let-7a2启动子区域中VDRE的结合。(4)EMSA和ChIP鉴定了let-7a2基因上游的VDRE(-1730---1706 bp)，并证实VDRE参与1，25-(OH)2D3对let-7a2基因表达的正向调控作用。(5)在肺癌组织中，let-7a2和VDR mRNA表达密切相关，二者较正常肺组织均降低的占44％（18例中8例），二者表达呈正相关的占67％（18例中12例）。(6)成功构建了let-7a2真核表达质粒，在肺腺癌细胞A549中能有效表达，并且抑制A549细胞增殖，促其凋亡。
结论：let-7a2与肺癌有密切关系，其在肺癌细胞A549中的表达可能受维甲酸、1，25-(OH)2D3、氯化锂和转录因子CEBPα调控。1，25-(OH)2D3通过VDR与let-7a2基因启动子区域中的VDR反应元件结合，发挥对let-7a2在肺癌中表达的正向调控作用。这一研究结果为进一步研究let-7a2和1，25-(OH)2 D3在肺癌中的作用奠定了基础。
肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，Takamizawa等发现肺癌患者的let-7表达显著降低，并且let-7表达水平越低，预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人肺癌细胞中瞬时表达let-7可以抑制细胞的增殖。let-7在肺癌的发生发展中作为一个抑癌基因在发挥作用。let-7a2是这个家族的成员之一，其基因定位于染色体11q24.1。
1，25一二羟维生素D3(1，25-(OH)2D3)是维生素D的体内活性形式，能够调节细胞的分化增殖，而这种作用是通过维生素D受体(VDR)介导发挥其生物学效应的。人类VDR基因位于染色体12q13.11，基因全长约4669bp。VDR蛋白为配体依赖性转泵因子，1，25-(OH)2D3通过激活VDR，进而形成VDR/RXR/辅转录因子复合体，与靶基因启动子区域的VDR应答元件(VDRE)识别结合，影响RNA聚合酶II介导的某些基因转录，影响细胞的生长、分化、凋亡等过程。l，25-(OH)2D3可降低肺癌细胞系的生长，促进细胞凋亡。VDR属于核转录因子，在肺癌组织中VDR mRNA的表达下调。VDR表达和功能的改变可能导致细胞对l，25-(OH)2D3的反应性变化，而改变对细胞的生长、分化、凋亡等过程的调控。
let-7a2在肺癌中作用及表达调控的机制尚未见研究报道，并且在研究let-7a2表达调控时发现，l，25-(OH)2 D3可在转录水平上调let-7a2在肺癌细胞A549中的表达，其调控机制及其在肺癌中的作用很有必要进行深入研究。本课题在基因启动子及转录水平研究1，25-(OH）2D3在肺癌中对let-7a2基因表达的调控作用，并初步探讨其调控机制。在此研究中，(1)首先利用5.RACE寻找到let-7a2基因5‘上游的转录起始点，进一步通过PCR扩增其5‘上游包含启动子的2.8 kb片段(+336bp至-2523bp)，构建let-7a2的2.8kb启动子.荧光素酶报道基因质粒并检测其在肺癌A549细胞中的启动子活性。(2)A549细胞经过9-顺维甲酸(9-cis-RA)、全反式维甲酸(AT-RA)、氯化锂(LiCl)、地塞米松(Dex)、1，25-(OH)2D3处理或者分别转染let-7a2启动子-荧光素酶报道基因质粒和let-7a2靶序列-报道基因融合质粒后，经9-cis-RA、AT-RA、LiC1、Dex、1，25-(OH)2D3处理48 h后，分别通过RT-PCR和荧光素酶活性检测，观察它们对let-7a2在A549细胞中表达的影响。(3)通过构建let-7a2基因5，上游VDR反应元件(VDRE)-绿色荧光蛋白报道基因质粒，转染A549细胞并经1,25-(OH)2 D3处理后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，了解1，25-(OH)2 D3激活VDR转录因子并与VDRE结合，促进报告基因表达的作用。(4)通过电泳迁移率改变实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀分析(CHIP)，检测在1，25-(OH)2D3作用下VDR与VDRE的结合活性。(5)收集18组临床肺癌标本，用RT-PCR方法检测let-7a2和VDR在肺癌组织中表达的相关性。(6)构建let-7a2真核表达质粒，并检测其在肺癌细胞A549中的表达及对A549细胞增殖凋亡的影响。
结果：(1)通过5’RACE，确定了let-7a2的转录起始点，并克隆了let-7a2基因5’上游2.8kb启动子片段，成功构建了let-7a2启动子-荧光素酶报告基因质粒，并且在肺癌细胞A549中显示有启动子活性。(2)9-cis-RA、AT-RA和1，25-(OH)2D3能够增强let-Ta2在肺癌细胞中的表达；而LiCI和转录因子CEBPα则使let-7a2在肺癌细胞中的表达降低。(3)1，25-(OH)2D3能够增强VDRE-绿色荧光蛋白报道基因质粒中绿色荧光蛋白的表达，表明1，25-(OH)2D3能促进VDR与let-7a2启动子区域中VDRE的结合。(4)EMSA和ChIP鉴定了let-7a2基因上游的VDRE(-1730---1706 bp)，并证实VDRE参与1，25-(OH)2D3对let-7a2基因表达的正向调控作用。(5)在肺癌组织中，let-7a2和VDR mRNA表达密切相关，二者较正常肺组织均降低的占44％（18例中8例），二者表达呈正相关的占67％（18例中12例）。(6)成功构建了let-7a2真核表达质粒，在肺腺癌细胞A549中能有效表达，并且抑制A549细胞增殖，促其凋亡。
结论：let-7a2与肺癌有密切关系，其在肺癌细胞A549中的表达可能受维甲酸、1，25-(OH)2D3、氯化锂和转录因子CEBPα调控。1，25-(OH)2D3通过VDR与let-7a2基因启动子区域中的VDR反应元件结合，发挥对let-7a2在肺癌中表达的正向调控作用。这一研究结果为进一步研究let-7a2和1，25-(OH)2 D3在肺癌中的作用奠定了基础。