可得然胶是一种主要由土壤杆菌属（Agrobacterium）细菌发酵产生的水不溶性胞外多糖,具有独特的凝胶性能,可作为增稠剂、凝固剂与稳定剂等广泛应用于食品工业中。研究发现土壤杆菌crd R和crd ASC基因与可得然胶合成相关,其中,crd R是可得然胶合成的正调控因子,crd S基因编码可得然胶合成酶催化亚基,将葡萄糖残基从可得然胶合成前体物质UDP-葡萄糖转移至多糖聚合物链上,crd A与crd C基因的功能尚不清楚。目前可得然胶合成调控机制相关研究少有报道,为了进一步完善对土壤杆菌合成可得然胶的代谢调控网络的认识,本文拟构建土壤杆菌CA03转座子突变文库,通过对突变菌株的高通量筛选及基因鉴定,以获得可得然胶合成相关基因,并对其所参与的可得然胶合成分子机制进行探索。本文以土壤杆菌CA03为受体菌,以SM10λpir/p SC189为供体菌,通过接合实验将质粒p SC189导入CA03菌株中,使转座子随机插入CA03菌株基因组中,实验结果显示,在受体菌与供体菌数量比例为4:1时,接合转移效率最高,达到3.3×10-3。随后通过链霉素与卡那霉素筛选阳性接合菌株,构建包含约3000个突变菌株的转座子突变文库。随机挑取突变文库中的9个突变菌株,通过TAIL-PCR鉴定转座子插入位点,结果显示转座子成功插入土壤杆菌CA03染色体DNA,且突变位点具有随机性。上述结果说明转座子突变文库构建成功,可用于可得然胶合成相关基因的筛选。接下来通过高通量筛选土壤杆菌CA03转座子突变文库,以获得显著影响可得然胶合成的突变菌株,并对其突变基因进行鉴定。通过初筛1380株突变菌株,复筛183株突变菌株,最后获得13株产量降低70%以上的突变菌株,2株产量提高10%以上的突变菌株。通过对突变菌株的突变基因进行鉴定及功能分析,发现低产菌株突变基因有phb C,gln A、thi G、dks A、pur F、nus A、pp K、met H、met Z,主要参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢、丁酸代谢、氧化磷酸化、氮代谢、嘌呤代谢、硫胺素代谢等不同代谢通路,高产菌株突变基因为Atu3059与At1D1460-21360,Atu3059基因编码Na+/H+逆向转运蛋白,At1D1460-21360基因编码假定蛋白。随后本文对都参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的met Z与met H基因对可得然胶合成的影响进行进一步探究。首先构建土壤杆菌CA03 met Z与met H基因敲除菌株以及回补菌株。摇瓶发酵验证基因敲除菌株与基因回补菌株可得然胶产量,发现基因敲除菌株Δmet Z可得然胶粗产量为4.57 g/L,相比于野生菌株降低了89.09%,基因回补菌株Δmet Z::met Z可得然胶粗产量为22.87 g/L,是菌株Δmet Z可得然胶粗产量的5倍。基因敲除菌株Δmet H可得然胶粗产量为23.56 g/L,相比于野生菌株降低了43.77%。基因回补菌株Δmet H::met H可得然胶粗产量为34.65 g/L,与菌株Δmet H相比,产量提高了47.07%。可得然胶结构性质分析表明,菌株Δmet H与野生菌株CA03发酵所产可得然胶结构基本一致,但Δmet H菌株发酵产可得然胶凝胶强度及分子量都高于野生菌株CA03。Δmet Z与Δmet H菌株生长情况与野生菌株CA03无明显差异,说明基因敲除菌株可得然胶产量的降低并非生长受损引起。通过各菌株的发酵代谢曲线分析发现,野生菌株和回补菌株在24 h内氨氮耗尽,菌株Δmet H在36 h内体系中氨氮全部被消耗,而菌株Δmet Z氨氮消耗速率较慢,发酵结束后仍有部分剩余。另外,菌株Δmet H与Δmet Z蔗糖利用率较低,发酵96 h,蔗糖利用率分别为60.08%与24.63%,而野生菌株CA03蔗糖利用率为79.80%。结果说明Δmet Z与Δmet H菌株氨氮和蔗糖利用率都发生了不同程度的降低,从而影响了可得然胶的合成效率。为了进一步分析met Z与met H基因如何参与可得然胶合成的代谢调控,本文对基因敲除菌株和野生菌株进行了转录组和代谢组分析。转录组分析结果显示,基因敲除菌株Δmet Z和Δmet H与野生菌株CA03相比共有的差异表达基因有197个,这些差异基因主要分布于氧化磷酸化、硫代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等代谢通路中。met Z与met H基因的敲除对土壤杆菌合成可得然胶过程中糖代谢途径影响较小,而参与电子传递链的很多基因表达下调,表明在Δmet Z与Δmet H菌株中,电子传递链中能量ATP再生受到影响,进而使可得然胶的合成过程中能量供应不足,导致可得然胶产量明显降低。met H与met Z基因参与半胱氨酸与蛋氨酸代谢,在Δmet Z和Δmet H菌株中,蛋氨酸合成酶基因与由蛋氨酸合成甲硫醇的基因表达下调。表明met H与met Z基因的敲除影响了蛋氨酸的合成,进而影响了甲硫醇合成。推测甲硫醇参与可得然胶的合成过程。此外,Δmet Z菌株中,糖ABC转运体相关基因也有很多下调,可能影响菌株的糖转运,进而影响糖利用率,从而影响可得然胶的合成,该结果与基因敲除菌株代谢曲线中糖利用率降低的结果一致。代谢组分析结果显示,与CA03菌株相比,Δmet Z与Δmet H菌株对糖的利用率较低,导致UDP-葡萄糖等糖类代谢物堆积。另外,由于Δmet Z与Δmet H菌株TCA循环中间产物的堆积,使TCA循环减弱。同时,由于FAD大量堆积,说明FADH2合成受阻,表明电子传递链中还原力减弱,进而使能量合成受到影响。另外,在转录组分析中发现电子传递链中ATP合酶基因表达下调,使ADP转换为ATP减弱,最终导致ADP堆积。因此,推测由于ATP供能不足,使得可得然胶合成酶利用底物UDP-葡萄糖合成可得然胶的反应大大降低,从而导致基因敲除菌株可得然胶产量降低。此外,通过代谢组分析基因敲除菌株和野生菌株的氨基酸代谢,发现Δmet Z与Δmet H菌株中L-蛋氨酸显著低于野生菌株CA03,结果验证了met Z与met H基因参与L-蛋氨酸合成和代谢的功能。同时,发现Δmet Z菌株发酵液中以L-蛋氨酸作为底物合成的群体效应信号分子C6-HSL含量显著降低,而已有研究报道C6-HSL信号分子参与调控胞外多糖的合成。这些结果表明met Z与met H基因通过影响L-蛋氨酸的合成,进而影响群体效应信号分子C6-HSL的合成,最终对可得然胶的合成造成影响。上述结果说明,met Z与met H基因的敲除导致可得然胶的合成受到严重的影响,可见其参与可得然胶合成的代谢调控网络,并在可得然胶合成过程中具有重要的作用。综上所述,本文构建了土壤杆菌CA03转座子突变文库,并通过对突变菌株的筛选与鉴定,获得11个可得然胶合成相关基因。通过分析发现参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的met Z与met H基因对可得然胶合成具有重要的作用,met Z与met H基因敲除后菌株氨氮和蔗糖利用率降低,能量合成受损,且L-蛋氨酸合成受阻,最终导致可得然胶合成过程中底物利用率降低和能量供应不足,产量降低。通过本课题的开展,为土壤杆菌可得然胶合成代谢网络的不断完善奠定了理论基础,为通过分子生物学方法提高可得然胶产量提供理论支持。