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脊椎动物卵母细胞成熟分裂和早期胚胎发育过程均受到多种蛋白激酶的调节。近年来对于卵母细胞成熟、激活和受精的分子机制研究取得了很多进展。Aurora激酶是广泛分布在真核生物体内的丝/苏氨酸蛋白激酶家族,有证据证明Aurora激酶在哺乳动物卵母细胞成熟和激活过程中也起着关键性的作用。在哺乳动物,已发现Aurora激酶的同源蛋白,分别为Aurora-A、-B和-C。它们具有相似的结构,即相对保守的C末端和长度多变的N末端；但这3种同源蛋白在自身表达、亚细胞定位及酶激活时间等方面都各不相同。Aurora-B是丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员。由于Aurora-B激酶在许多实性肿瘤中过量表达,表现出致癌基因的作用,在癌症研究中Aurora-B常被作为治疗的重要靶点。最近的研究表明,Aurora-B在调控卵母细胞成熟分裂进程和早期胚胎发育的相关信号通路上扮演着重要角色。哺乳动物卵母细胞的成熟分裂阻滞和恢复的机制,以及受精卵早期发育过程中,尤其是首次有丝分裂由1-细胞(合子)向2-细胞转换的机制,是当前生殖和发育生物学研究的热点之一。研究Aurora-B对猪卵母细胞成熟分裂和辅助受精后首次卵裂的调控,对于认识生殖发育机理、实施生殖调控都具有重要的意义。目前,虽然在Aurora-B调控低等动物(如非洲爪蛙)卵母细胞成熟分裂进程和相关信号通路上取得了一些成果,但有关Aurora-B在哺乳类卵母细胞成熟分裂及早期胚胎发育过程中的表达定位与功能研究较少。已有的报道主要集中在小鼠受精卵和爪蛙卵母细胞上,有关猪卵母细胞成熟分裂和首次有丝分裂过程中Aurora-B mRNA或蛋白的表达规律与功能迄今未见报道。胞质内单精注射(ICSI)技术在哺乳动物上的应用十分广泛,已在诸多领域发挥出它的独特作用。应用ICSI技术体外生产胚胎,有助于准确掌握受精时程,便于观察精卵融合及重要受精事件的发生。ICSI作为实验手段已被广泛用于受精生物学研究,是开展受精基础研究的有效实验模型。本研究将ICSI操作、荧光定量PCR分析和免疫荧光染色技术相结合,检测猪卵母细胞成熟分裂和ICSI胚胎首次有丝分裂过程中Aurora-B mRNA和蛋白的动态表达及亚细胞定位；在此基础上,通过Aurora-B的特异性抑制剂AZD-1152的特异性抑制试验,分析Aurora-B对猪卵母细胞成熟和单精注射后首次卵裂进程的影响,以期为了解猪卵母细胞成熟分裂和胚胎早期发育的分子机制提供实验依据。实验结果如下：1.猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora-B mRNA水平的变化在猪卵母细胞成熟分裂过程中,0h(GV期)时,Aurora-B mRNA表达量最高；20 h的表达量最低；在30、36和44 h表达量虽有所升高,但仍显著低于0h组(P<0.05)。而30和44 h的Aurora-B mRNA表达水平高于20和36h组。2.猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora-B与α-tubulin的共定位0h GV期卵母细胞,微管未开始组装,Aurora-B均匀分布在细胞质中,未检测到其特异性存在；GVBD发生后,Aurora-B蛋白与a-tubulin集中分布于染色体附近,合成图像显示两者完全重迭；随着成熟分裂进行至MⅠ期,染色体排列在赤道板上,Aurora-B的定位也与a-tubulin重迭。MⅠ后期,Aurora-B仍定位于纺锤体上；临近MⅡ期,Aurora-B的定位则随着纺锤体位置的改变而有变化,主要定位于卵母细胞核及第一极体(pbI)。3.AZD-1152对猪卵母细胞成熟和细胞骨架的影响用Aurora-B特异性抑制剂AZD-1152处理后,阻滞在Pro MI-AI-TI期卵母细胞较对照组明显增加(P<0.05),达到MⅡ期的卵母细胞显著减少(P<0.05),同时MⅡ期卵母细胞发生染色体排列紊乱、纺锤体形态异常、微丝断裂和分散的比例增加。4.抑制猪卵母细胞Aurora-B表达对孤雌胚胎发育的影响用AZD-1152抑制猪卵母细胞Aurora-B的表达,与对照组相比,AZD-1152处理组的卵裂率、囊胚发育率和囊胚细胞总数均有显著降低,降低的程度随着所用AZD-1152浓度的增加而增加；抑制猪卵母细胞Aurora-B表达,孤雌胚胎的发育受到严重影响。5.猪ICSI胚胎首次有丝分裂进程的观察ICSI重构胚激活后18h,雌雄原核已完成融合,合子形成,受精完成。20h时,姐妹染色单体在纺锤丝的牵引作用下,向细胞两极分离。22h时,染色质已位于细胞两极,卵裂沟形成,细胞质进入分裂状态。到了24h,细胞质分裂完成,胚胎完成首次有丝分裂过程。6.猪ICSI胚胎首次卵裂过程中Aurora-B mRNA的表达随着首次有丝分裂的进行,猪ICSI胚胎激活后20、22和24 h, Aurora-B mRNA的表达均较18h组显著升高(P<0.05),且在24 h达到最高,并显著高于其它各组。22h组与20h组相比,Aurora-B mRNA表达水平有所降低,但差异不显著(P>0.05)。7.猪ICSI胚胎首次卵裂过程中Aurora-B与a-tubulin的共定位在18h时,合子处于首次有丝分裂过程,此时Aurora-B在极体附近表达较高；到了20h时,细胞处于有丝分裂后期,Aurora-B蛋白的定位与纺锤体的位置完全重合；22h时,Aurora-B的定位与染色体的位置重合；24h时,细胞分裂末期,Aurora-B依然与微管的位置重迭,其定位紧随纺锤体。8.抑制Aurora-B表达对猪单精注射胚胎首次卵裂的影响利用特异性抑制剂AZD-1152抑制Aurora-B表达,发现随着抑制剂浓度的增大,猪ICSI重构胚形成单个细胞核的几率显著增加；而对胞质分离的抑制作用也较为明显,随抑制剂浓度的增加,处理组卵裂率与对照组相比显著降低。9.抑制Aurora-B表达后猪单精注射胚胎首次卵裂过程中Aurora-B及Mad2 mRNA的变化用AZD-1152抑制Aurora-B表达后,单精注射胚胎的Aurora-B与Mad2mRNA表达水平均有不同程度下降。20和24 h处理组胚胎Aurora-B mRNA表达水平较对照组显著下降。对照组Mad2 mRNA表达水平在18、22和24h差别不大,但20h组表达水平最高；而处理组胚胎Mad2 mRNA的表达水平均较对照组降低,在20h组表达最低。