论文部分内容阅读
目的:肺炎支原体是引起呼吸道感染的常见的病原菌,此外,它也是大多数社区获得性肺炎患者的主要致病菌之一。由该致病菌导致的机体发病率在最近几年显著升高。在中国,肺炎支原体感染发生率超过15%,部分省份情况更为严重,高达20%-30%,极大影响了人们的生活质量和生命健康。虽然目前肺炎支原体的诊断方法种类繁多,但是由于它感染机体后引起的临床症状并不具有特征性,加之临床上缺乏早期有效的诊断方法,因而发展一种快速、简便、低成本的检测方法对提高治愈率,减少过度使用抗生素和减轻病人的痛苦及其经济压力起着至关重要的作用。本研究基于检测物肺炎支原体的特异性DNA序列与G6-P荧光探针的特异性结合以及氧化石墨烯的荧光淬灭效应,从而实现肺炎支原体DNA的快速检测。方法:本研究引入了一种标记荧光的探针链,该探针的5’端可以共聚生成G-四联体,而3’末端连有FAM荧光素,并且靠近3’端的DNA序列可以和目标物肺炎支原体的DNA特异性结合。在没有目标物肺炎支原体DNA存在的情况下,G-四联体游离的单链DNA部分能够被氧化石墨烯所吸附,几乎所有的荧光被氧化石墨烯淬灭,当体系中加入肺炎支原体DNA后,DNA能够和G-四联体的3’端的单链特异性结合形成双链,G-四联体脱离氧化石墨烯,荧光信号得以重建,通过监测荧光信号强弱程度的变化来实现肺炎支原体的快速检测。结果:本研究利用GO的荧光淬灭特性,通过G-四联体探针进行信号传导,构建DNA生物传感检测微平台,检测肺炎支原体特异性保守DNA。在没有检测物肺炎支原体DNA存在的情况下,G-四联体荧光探针的荧光可以在2 min内被氧化石墨烯所淬灭,淬灭效率达到90%以上,当体系中加入检测物肺炎支原体DNA后,G-四联体荧光探针的荧光信号得以恢复,荧光信号恢复值在10 min内达到平衡状态,1 min内荧光信号恢复率高达原始荧光的60%。该方法检测线性范围为5-300 nM,荧光强度F和肺炎支原体DNA的浓度c之间的线性回归方程为F=20.48+0.49′c(R~2=0.998),检测线为3.96 nM,可以实现低浓度的目标DNA的检测。在特异性实验中,我们研究了检测物肺炎支原体DNA以及单个错配碱基,三个错配碱基和随机DNA序列的检测,其荧光强度的改变分别是空白对照组的6.06,4.77,3.43以及1.27倍,肺炎支原体DNA的荧光强度可以得到明显的区分。结论:本文通过优化检测条件、可行性验证以及临床标本的回收实验的检测,建立了一种的操作简单,检测速度快,灵敏度较高、特异性强的方法。该平台能够实现肺炎支原体的早期检测,为研制与开发新型的肺炎支原体DNA诊断方法起到积极的推动作用。