研究目的:近年来,越来越多的证据表明,肝脏不仅是机体最大的代谢解毒器官,也是机体重要的免疫器官,并且具有独特的免疫学特点。肝脏独特的生理功能、解剖结构和组织微环境促使其含有独特的免疫细胞组成、细胞亚群和功能分子,形成了独特区域免疫的特性,这些特点也促使肝脏成为以天然免疫细胞(NK、NKT和γδ T细胞)占优势的免疫器官。现已在肝脏内发现一群具有组织特异性的CD49a+DX5-NK细胞,这群细胞只在肝脏大量聚集并具有不同于外周血和其他部位NK细胞的独特表型和功能特点,其他天然免疫细胞是否亦能够特异性存在肝脏并具有独特的表型和功能特点尚缺乏系统研究。γδ T细胞是一个具有天然免疫特性的独特的免疫细胞群体,其在淋巴细胞中所占比例虽低,但应答迅速,在面对外来微生物感染或应激状态下能够迅速产生细胞因子,发挥抗细菌、病毒感染和抗肿瘤的作用,被视为机体免疫防御和免疫监视的第一道防线。γδ T细胞在肝脏中的比例远高于外周血,约占肝脏T细胞的15-25%左右,肝脏独特的区域免疫学特性亦赋予肝脏γδ T细胞不同于其他部位γδ T细胞的功能特点,但肝脏中是否含有特异性驻留于肝脏的γδ T细胞以及它们在维持肝脏独特的免疫微环境中的作用尚不清楚。在HBV慢性感染发生时,可使肝脏的免疫耐受状态加重,抑制肝脏微环境中免疫细胞(包括CD8+T细胞和NK细胞)的功能,甚至导致这些细胞功能耗竭,主要表现为细胞数量和分泌的细胞因子减少、细胞活化降低,同时伴随着细胞表面活化性受体表达下降和抑制性受体表达升高。免疫细胞功能的减弱促进了HBV逃逸免疫系统的监视和攻击,但HBV逃逸免疫细胞攻击的确切机制尚不明确。本研究一方面通过比较小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞的表型差异发现了一群仅存在于肝脏中的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,这群细胞具有肝脏驻留的特性。在小鼠HBV急性感染模型中,肝脏CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例和分泌IFN-γ的水平均增高,提示这群细胞在抵抗HBV急性感染中的重要作用。另一方面,我们发现HBV慢性感染时转录因子Eomes可促进CD8+T细胞表面抑制性受体的表达,促进T细胞耗竭和HBV免疫逃逸;转录因子GATA-2和GATA-3可与HBx蛋白形成三聚体进而抑制NKG2D配体MICA的表达,削弱NK细胞对HBV感染的肝癌细胞的杀伤能力,促使HBV感染的肝癌细胞逃逸NK细胞的杀伤。方法:1流式细胞术检测了 C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺、骨髓、外周血和小肠上皮内γδ T细胞的比例。2 Q-PCR和流式细胞术检测C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞表面的趋化因子受体、粘附分子、与细胞因子分泌相关的标记和细胞表面受体的表达。3流式细胞术检测成年鼠肝脏中CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例、细胞表面驻留相关标记和细胞内转录因子的表达。4 RT-PCR检测胎鼠和成年鼠胸腺和肝脏中γδ T细胞的亚群,流式细胞术检测胎鼠到成年鼠各个阶段胸腺和肝脏中γδ T细胞的比例、CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例、细胞表面驻留相关标记和细胞内转录因子的表达。5建立CD45.1和CD45.2联体小鼠模型,流式细胞术检测CD45.1+和CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T在CD45.1和CD45.2小鼠体内的分布。6灌流法提取小了鼠肝窦内皮细胞并进行体外培养,24h后收集上清,ELISA检测收集的上清中趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL16的水平;Transwell法检测肝窦内皮细胞对CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的趋化作用。7灌流法提取小鼠肝窦内皮细胞,流式细胞术检测肝窦内皮细胞表面integrinβ7的表达。8分离小鼠肝淋巴细胞,体外经PMA/ion刺激,BFA阻断细胞因子分泌后,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌IFN-y和IL-17的水平及转录因子RORyt和T-bet的表达。9流式细胞术分选肝脏和胸腺中处于发育不同阶段的T细胞前体,Q-PCR检测转录因子 Eomes、PU.1、PLZF、Sox13、Rorc、Sox4 和 Id3 的表达。10分离C57BL/6J和GKO小鼠肝淋巴细胞,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T的比例。11尾静脉高压注射pAAVHBV1.2质粒建立小鼠HBV急性感染模型,分别在感染后的3d、7d、10d和14d检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T的比例和分泌IFN-y和IL-17的水平。12流式细胞术分选CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞,过继转输到TCRδ-/-鼠中,分别以WT鼠、TCRδ-/-鼠和过继转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T的TCRδ-/-鼠建立HBV急性感染模型,在高压注射HBV后0.5W、1W、2W、3W和4W时尾静脉取血,分离血清,化学发光法检测血清中HBsAg和HBeAg的含量。13建立小鼠HBV慢性感染模型,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞比例和分泌细胞因子的水平,以及CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞表面活化性受体CD69和抑制性受体PD-1、LAG-3和CTLA4的表达。14建立小鼠HBV慢性感染模型,分离肝脏和脾脏淋巴细胞后,用流式细胞术检测了 CD4+T和CD8+T细胞表面抑制性受体BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3的表达。15建立小鼠HBV的慢性感染模型,分离肝脏和脾脏淋巴细胞后,流式细胞术检测 Eomes+CD8+ T 细胞、Eomes-CD8+ T 细胞、Eomes+HBV 特异性 CD8+ T 细胞和Eomes-HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性受体BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1 和 LAG-3 的表达。16分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,分离小鼠肝淋巴细胞后,流式细胞术检测CD8+ T细胞和HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性受体的表达。17分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,分离肝脏淋巴细胞体外经PMA/ion刺激、BFA阻断细胞因子分泌后,用流式细胞术检测HBV特异性CD8+ T细胞分泌TNF-α、IL-2和IFN-γ的水平。18分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,在尾静脉高压注射HBV质粒后3W、4W、5W、6W和12W尾静脉取血,化学发光法检测血清中HBsAg、HBeAg水平和HBV DNA的载量,用免疫组化检测HBV慢性感染模型建立成功的C57BL/6J小鼠和EKO小鼠肝组织中HBcAg的含量。19提取WT和EKO小鼠肝淋巴细胞,Q-PCR检测NFATc1、Blimp1、FoxO1和Nfil3的水平,Western Blot技术检测NFATc1的表达。20染色质免疫共沉淀技术检测Eomes与肝淋巴细胞中CD160和LAG-3启动子的结合。21 以 HepG2、HepG2.2.15、HepG2-N1 和 HepG2-HBV 为研究对象,用 Q-PCR和流式细胞术检测细胞中NKG2D配体的表达。22 以 HepG2、HepG2-HBV 和 HepG2.2.15 为研究对象,加入 MICA/B 和 NKG2D的阻断抗体后,CFSE/7AAD法检测NKL细胞对其的杀伤活性。23 HepG2 细胞转染 pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs 和 pEGFP-HBp后,Western Blot技术检测肝癌细胞表面MICA的表达。24 以 HepG2-N1、HepG2-X 和 HepG2-C 为研究对象,加入 MICA/B 和 NKG2D的阻断抗体后,CFSE/7AAD法检测NKL细胞对其的杀伤活性。25 用 GATA-2 siRNA 和 GATA-3 siRNA 沉默 HepG2 细胞 GATA-2 和 GATA-3的表达,Western Blot技术检测MICA的表达。26免疫共沉淀技术检测HBx、GATA-2和GATA-3是否可形成三聚体。27染色质免疫共沉淀技术检测HBc蛋白是否可与MICA和MICB启动子中的CpG岛区结合。结果:一、肝脏特有的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群的发现1肝脏存在特有的γδ T细胞流式细胞术检测C57BL/6J小鼠的骨髓、小肠上皮内、淋巴结、肝脏、皮肤、脾脏和胸腺内γδ T细胞的比例,发现除了富含γδ T细胞的皮肤和小肠上皮外,肝脏内γδ T细胞的比例也很高,说明肝脏也是富含γδ T细胞的器官之一。同时,比较了裸鼠和C57BL/6J小鼠小肠上皮、淋巴结、肝脏和脾脏中γδ T细胞的比例,发现裸鼠肝脏中依然存在γδ T细胞,虽然比例低于C57BL/6J小鼠,这说明肝脏中存在一群特有的γδ T细胞,它们的存在不受胸腺的影响。2肝脏中存在CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群Q-PCR和流式细胞术检测发现CXCR3和CXCR6在肝脏中特异性高表达,进而发现了一群只在肝脏中存在的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,流式细胞术检测这群细胞的表面标记和转录因子,发现这群细胞表达的细胞驻留性标记CD 103、CD69、CD44、CD49a 和 PLZF 的水平较高,提示肝脏中 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可能是驻留在肝脏的,是肝脏特有的一群γδ T细胞。3 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群从胚胎期一直存在首先,我们用普通PCR检测了胚胎和成年时期肝脏和胸腺内γδ T细胞的亚群,发现胚胎期间肝脏一直存在Vγ2和Vγ4的γδ T细胞,用流式细胞术进一步验证了小鼠从胚胎期到成年一直存在γδ T细胞,并且CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群从胚胎到成年也一直存在。接下来,我们发现胚胎期到成年期CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群的驻留相关的标记和转录因子表达一致,说明这群细胞从胚胎时期一直驻留在肝脏中,是肝脏特有的γδ T细胞亚群。4 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞是特异性驻留于肝脏的γδ T细胞亚群在CD45.1和CD45.2联体小鼠模型中发现CD45.1+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T几乎全部存在于CD45.1小鼠肝脏中,CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T也几乎全部存在于CD45.2小鼠肝脏中,说明CD45.1+和CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞没有进入体循环,是驻留于小鼠肝脏中的。5肝窦内皮细胞促进CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞在肝脏驻留ELISA结果发现小鼠肝窦内皮细胞分泌高水平的CXCL9、CXCL11和CXCL16。Transwell实验证明肝窦内皮细胞可通过分泌CXCL9、CXCL11和CXCL16 募集 CXCR3~+CXCR6~+γδ T,中和 CXCL9、CXCL11 和 CXCL16 后,肝窦内皮细胞对CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的募集作用减弱,而肝窦内皮细胞表面的integrinβ7与CD103结合促进CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的驻留。6 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞是分泌IFN-γ为主的细胞流式细胞术检测结果发现CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌IFN-y的水平高于IL-17,并且转录因子T-bet的表达高于RORγt。肝脏T细胞前体中调控IFN-γ分泌的相关转录因子高于调控IL-17分泌的相关转录因子。7 IFN-γ缺失不影响CXCR3+CXCR6+ γ δ T细胞的比例GKO小鼠肝脏中CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞没有变化,说明小鼠缺失IFN-y不影响CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例。8 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞参与抵抗HBV急性感染流式细胞术结果发现HBV急性感染早期CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌的1FN-γ减少,HBV急性感染7d以后,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌的IFN-y增加。向TCRδ-/-鼠中转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞后发现小鼠体内HBsAg和HBeAg的量明显降低,说明CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可参与抵抗HBV急性感染,并且在一定条件下产生IL-17增多。在小鼠HBV慢性感染模型中,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例略有下降,分泌IFN-γ量增多,IL-17的量不变,同时CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞表面的活化性受体CD69表达增加,抑制性受体PD-1、LAG-3和CTLA4的表达基本不变。二、HBV感染时转录因子对免疫细胞受体及配体表达调控的研究1 HBV慢性感染导致T细胞表面抑制性分子表达升高HBV慢性感染小鼠肝脏和脾脏中CD4+和CD8+ T细胞表面的抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3表达均高于正常小鼠,尤其是肝脏中的CD8+ T细胞更为明显,说明HBV慢性感染可加重肝脏的免疫抑制状态。2 Eomes与CD8+T细胞表面抑制性分子的表达呈正相关HBV慢性感染小鼠肝脏中Eomes+的CD8+ T细胞表达抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1 和 LAG-3 的水平高于 Eomes的 CD8+ T 细胞。HBV慢性感染的WT鼠肝脏中CD8+ T细胞表面制性分子的表达高于EKO小鼠。这些结果说明Eomes可促进CD8+T细胞表现抑制性分子的表达。3 WT小鼠肝脏HBV特异性CD8+ T细胞抑制性分子的表达高于EKO小鼠小鼠肝脏中Eomes+的HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子PD-1、Tim-3、CD160和LAG-3的表达水平高于Eomes-的HBV特异性CD8+ T细胞;WT鼠肝脏中HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子的表达水平也高于EKO鼠。饼图分析结果提示Eomes可促进HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子的共表达。4 WT和EKO小鼠肝脏HBV特异性CD8+ T效应功能无明显区别WT鼠HBV特异性CD8+ T细胞分泌的IL-2、TNF-α和IFN-γ水平与EKO小鼠没有区别,说明Eomes不影响CD8+ T细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的能力。5 Eomes缺失可促使HBV病毒的快速清除WT鼠尾静脉高压注射HBV质粒后血清中HBs抗原、HBe抗原水平、HBV DNA的载量和肝脏中HBcAg的含量均高于EKO鼠,表明小鼠缺失Eomes分子后,清除HBV病毒的能力更强。6 Eomes可直接与CD160启动子结合进而促进CD160的表达WT小鼠肝脏淋巴细胞NFATc1、Blimp-1和FoxO1的表达水平均高于EKO小鼠,染色质免疫共沉淀结果显示转录因子Eomes可直接与抑制性分子CD160启动子序列结合,直接调控其表达。7 HBV阳性肝癌细胞表面NKG2D配体的表达低于HBV阴性肝癌细胞Q-PCR和流式结果显示HepG2.2.15和HepG2-HBV细胞表面NKG2D的配体MICA、MICB和ULBP1,2,3的表达低于HepG2和HepG2-N1细胞,NK细胞对HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞的杀伤活性明显低于HepG2细胞,MICA/B和NKG2D阻断抗体可进一步降低NK细胞对肝癌细胞的杀伤。8 HBx基因和HBc基因明显下调HepG2细胞表面NKG2D配体流式细胞术和Western Blot结果显示转染HBx和HBc基因后,HepG2细胞表面的MICA表达明显降低。HepG2-X和HepG2-C细胞对NK细胞杀伤敏感性明显低于HepG2-N1细胞,MICA/B和NKG2D阻断抗体可进一步降低肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。9 GATA-2和GATA-3抑制肝癌表面MICA的表达经网站预测发现MCA启动子上含有转录因子GATA-2和GATA-3的结合位点,HepG2.2.15细胞中沉默GATA-2和GATA-3表达后,MICA的表达增加。10 HBx和GATA-2/GATA-3共同抑制MICA的表达染色质免疫共沉淀结果显示GATA-2和GATA-3可以直接结合在MICA启动子上,沉默HBx基因后,GATA-2和GATA-3与MICA启动子的结合降低。免疫共沉淀实验证明GATA-2、GATA-3和HBx蛋白可以形成三聚体。11 HBc核心蛋白可直接与MICA启动子的CpG岛结合抑制MICA的表达染色质免疫共沉淀显示HBc蛋白可直接与MICA和MICB启动子上的CpG岛结合,而HBc蛋白不能与GATA-2和GATA-3形成三聚体。结论及意义:1本研究通过比较小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞的表型差异,首次发现了一群仅存在于肝脏中的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,并且这群细胞具有肝脏驻留的特性。在小鼠HBV急性感染模型模型中,过继转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可抵抗HBV急性感染;在HBV慢性感染模型中,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞产生更多的IFN-γ并高表达CD69,细胞处于活化状态,提示我们这群细胞可能不参与维持肝脏免疫耐受,但发挥的具体作用还不清楚,还需进一步验证。2我们首次发现HBV慢性感染时转录因子Eomes可促进CD8+ T细胞表面抑制性受体的表达、促进T细胞耗竭和HBV免疫逃逸;转录因子GATA-2和GATA-3可与HBx蛋白结合形成三聚体进而抑制肝癌细胞NKG2D配体MICA的表达,削弱HBV感染的肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性,促使HBV感染的肝癌细胞逃逸NK细胞的杀伤。此结果不仅揭示了 HBV通过转录因子Eomes、GATA-2和GATA-3调节免疫细胞受体或配体的表达逃逸免疫细胞攻击的机制,而且为HBV的治疗提供了新的靶点和思路。