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研究目的:在我国,胃癌是一种高发病率的恶性肿瘤严重危害人民健康。蛋白质的糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰,在肿瘤的发展和转移过程中均伴有蛋白质异常糖基化修饰的产生。然而异常的糖基化修饰在肿瘤进程中的作用有待进一步阐明。因此,本研究以胃癌细胞及不同分期胃癌患者组织为研究对象,筛选与胃癌相关的异常糖基化修饰,解析糖链结构,分析异常糖基化的合成通路以及其对胃癌细胞侵袭和转移等生物学行为的影响,本研究将为阐明异常糖基化修饰在胃癌发展中的作用机制提供帮助。方法:1.利用凝集素芯片分析胃癌细胞/胃癌组织的糖蛋白糖链谱,筛选与胃癌相关的异常糖蛋白糖链,随后通过凝集素组织化学以及凝集素细胞化学方法在细胞水平上验证筛选的异常糖蛋白糖链;2.构建朝鲜槐凝集素(Maackia amurensis I,MAL-I)-磁性微粒复合物,分别从胃癌细胞/胃癌组织蛋白中分离MAL-I特异性识别的糖蛋白并释放糖链,借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术解析N-聚糖结构,比较分析胃癌组织和细胞中改变的N-聚糖结构;3.利用糖基因芯片技术在胃癌组织样本中筛选参与异常糖蛋白糖链合成并且表达发生改变的糖相关基因,结合The cancer genome atlas(TCGA)数据库以及Gene Expression Omnibus(GEO)数据库进一步分析其在胃癌中的表达情况,通过Real-Time PCR以及免疫印记技术验证筛选结果;4.构建β-1,4-半乳糖基转移酶III(beta-1,4-galactosyltransferase 3,B4GALT3)基因沉默及过表达慢病毒载体,利用胃癌细胞SGC-7901构建B4GALT3沉默及过表达细胞系,分析B4GALT3对胃癌细胞生物学行为的影响。结果:1.对5株胃癌细胞系及正常胃粘膜上皮细胞的糖蛋白糖链谱分析结果显示,凝集素MAL-I、ACA以及SNA在5株胃癌细胞系中的相对丰度均显著高于正常胃黏膜上皮细胞(Human Gastric Epithelial cell strain,GES-1)。凝集素细胞化学分析结果显示,MAL-I识别的糖链结构在胃癌细胞的细胞膜及胞外基质区域出现异常积累。这一结果也与凝集素芯片结果的整体趋势一致;2.对46对胃癌及癌旁组织的糖蛋白糖链谱分析结果显示:伴随着肿瘤的发展MAL-I识别的N-乙酰乳糖胺(N-acetyllactosamine,LacNAc)在肿瘤组织中的相对丰度呈现持续增长的趋势,并且LacNAc在晚期胃癌及淋巴结转移的胃癌患者中的高表达比率高于早期胃癌以及淋巴结转移阴性的胃癌患者。凝集素组织化学分析结果显示,LacNAc在胃癌组织的细胞膜及胞外基质区域出现异常积累。这一结果也与凝集素芯片结果的整体趋势一致。3.对胃癌组织和细胞中分离的N-聚糖结构的鉴定结果显示,在胃癌细胞中鉴定到的含LacNAc结构的N-聚糖种类多于正常细胞。胃癌组织的鉴定结果显示,伴随着肿瘤的发展进程,在II期及III期胃癌患者组织样本中鉴定到的含有LacNAc结构的N-聚糖种类较癌旁组织明显增多。另外,与早期(I期及II期)癌组织样本相比,在III期患者的癌组织样本中鉴定到的含有LacNAc结构的N-聚糖明显增多,其中,10种含有LacNAc结构的N-聚糖(例如,m/z 1625.605,1803.652以及1914.671等)只出现在III期患者的癌组织样本中。在这10种新出现的含有LacNAc结构的N-聚糖中有5种(例如,m/z 2034.634,2546.876以及2578.915等)末端被唾液酸化修饰,2种(m/z 2578.915和2873.046)末端出现Lewis抗原结构。4.糖基因芯片结果显示,负责LacNAc合成的糖基转移酶基因B4GALT3在II,III期癌组织中的表达明显高于癌旁组织。TCGA和GEO数据库分析结果表明,B4GALT3在胃癌组织中的表达显著升高,并与患者生存期相关。结合胃癌糖蛋白糖链谱的结果显示,在胃癌的发展过程中B4GALT3表达升高促进LacNAc合成进而引起LacNAc糖链在胃癌细胞膜和ECM上的异常积累。5.利用B4GALT3沉默及过表达慢病毒质粒构建B4GALT3沉默及过表达稳转细胞分析结果表明,B4GALT3表达影响胃癌细胞中LacNAc的合成。虽然B4GALT3表达对胃癌细胞的增殖能力无明显影响,但是能够促进细胞的迁移和侵袭能力并增强细胞克隆形成能力。结论:在胃癌的发展过程中,凝集素MAL-I识别的LacNAc在胃癌细胞和组织中均出现异常积累,并且伴随着胃癌的发展进程,在胃癌组织中含LacNAc结构的N-聚糖种类不断增多。而参与该糖链合成的糖基转移酶B4GALT3在胃癌细胞中表达升高是引起LacNAc合成增加的主要原因。虽然B4GALT3表达对胃癌细胞的增殖能力无明显影响,但是能够促进细胞的迁移和侵袭能力并增强细胞克隆形成能力。本研究筛选了与胃癌相关的异常糖基化修饰,并初步分析其化对胃癌发展和转移的影响,为胃癌的分子机制研究提供理论基础。