论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）作为一种慢性肾病,是糖尿病的严重并发症之一,也是导致终末期慢性肾病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因。糖尿病肾病的病理特征包括系膜基质增生、基底膜弥漫性增厚、肾小球结节状硬化以及肾小管萎缩等。糖尿病肾病的发病机制非常复杂,通常涉及诸多方面。高血糖,氧化应激,晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）的生成以及TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、PI3-K/Akt/m TOR、MAPK和TLRs信号通路的激活被认为是导致糖尿病肾病的主要原因,并在糖尿病肾病的细胞损伤和细胞外基质过度沉积中发挥关键作用。细胞周期素蛋白依赖性激酶5（Cyclin-dependent Kinase 5,Cdk5）是一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于细胞周期素依赖性激酶（Cdks）家族。与Cdks家族其它成员不同的是,Cdk5不参与细胞周期的调控,也不受细胞周期素的调节,其活性主要受特异性非细胞周期蛋白p35和p39的控制。近年来研究证实,Cdk5可以通过促纤维化的作用,来影响系统性硬化症（systemicscleroderma,SSC）以及肾小管间质纤维化（Tubulointerstitial fibrosis,TIF）的发生。但是目前尚不清楚其是否能够通过促纤维化作用来促进系膜细胞基质的合成,进而影响肾纤维化的发生。因此,本研究拟以糖尿病肾病患者肾活检组织与人系膜细胞（Human mesangial cells,HMC）为研究对象,探讨Cdk5在糖尿病肾病肾小球系膜细胞基质（Extracellular matrix,ECM）合成中的作用,确定其对肾小球硬化的影响,为明确糖尿病肾病的相关发病机制,探索靶向治疗糖尿病肾病提供实验依据。方法:1.Cdk5、FN和Col IV在糖尿病肾病患者活检肾组织系膜细胞中的表达收集2017-2020年间河北医科大学第二医院肾内科确诊的20例IIa期和IIb期糖尿病肾病患者的活检肾组织标本。患者年龄在30-50岁之间,病例资料完整;另选取20例因肾癌行肾切除术病例,选取远离肿瘤组织并且经病理认证为正常肾的组织作为对照组。过碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain,PAS）观察活检肾组织肾小球形态学的改变,免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）检测肾小球系膜区Cdk5、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）和Ⅳ型胶原（collagen IV,ColⅣ）的表达,统计学分析Cdk5与系膜细胞外基质FN和Col IV表达水平之间的关系。2.Cdk5在系膜细胞基质合成中的作用⑴Cdk5与p35/25在高糖培养的HMCs中的表达。以HMCs为研究对象,高糖分别刺激0、3、6、12、24 h后收集细胞,real-time PCR检测Cdk5 m RNA表达情况,western blot和免疫细胞荧光技术检测Cdk5与p35/25蛋白的表达及定位。⑵抑制Cdk5对高糖培养的HMCs中ECM合成的影响。（1）将HMCs随机分为对照组（control）、高糖刺激组（HG）和抑制剂组（HG+R）。在抑制剂组中,使用Cdk5抑制剂Roscovitine刺激高糖处理的HMCs,12h后收集细胞。Real-time PCR检测FN和Col IV m RNA的表达情况,western blot和免疫细胞荧光技术检测FN和Col IV蛋白的表达及定位。（2）将HMCs随机分为对照组（control）、高糖转染对照组（HG+pc DNA3.0）和高糖质粒敲除组（HG+DN-Cdk5）,细胞融合80%时分别转染空载质粒和Cdk5敲除质粒,孵育6-8 h后,加入30m M高糖刺激,12h后收集细胞。Real-time PCR检测FN和Col IV m RNA的表达情况;western blot和免疫细胞荧光技术检测FN和Col IV蛋白的表达及定位。⑶过表达Cdk5对HMCs中ECM合成的影响。随机将HMCs分为对照组（control）、转染对照组（pc DNA3.0）以及Cdk5过表达组（WT-Cdk5）。细胞融合80%时分别转染空载质粒和Cdk5过表达质粒,孵育6-8h后收集细胞。Real-time PCR检测FN和Col IV m RNA表达情况,western blot和免疫细胞荧光技术检测FN和Col IV蛋白的表达及定位。结果:1.Cdk5、FN和Col IV在糖尿病肾病患者活检肾组织系膜细胞中的表达⑴PAS染色显示活检肾组织中肾小球系膜区显著增宽,ECM沉积明显增加,基底膜（glomerular basement membrane,GBM）增厚。⑵IHC结果显示活检肾组织肾小球系膜区Cdk5表达明显增强,FN和Col IV在肾小球系膜区的表达也明显升高。统计学相关性分析显示,Cdk5的表达与FN和ColⅣ的表达呈显著正相关。2.Cdk5在系膜细胞基质合成中的作用⑴高糖培养的HMCs中,Cdk5和p35/25的表达均出现升高,且在12 h时升高最为显著。⑵抑制Cdk5对高糖培养的HMCs中ECM合成的影响。（1）结果显示,高糖刺激后,HMCs中FN和Col IV表达增强,而使用Roscovitine后,FN和ColⅣ表达出现了明显降低。（2）与空载质粒组相比,高糖质粒敲除组中FN和ColⅣ表达均显著降低。⑶过表达Cdk5对HMCs中ECM合成的影响。结果显示,与空载质粒组相比,转染Cdk5过表达质粒后,HMCs中FN和ColⅣ的表达水平均显著增强。结论:在糖尿病肾病中,高糖通过增强Cdk5的表达及激酶活性,促进HMCs中ECM的合成,参与肾小球硬化的发生。