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实验背景及目的:心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemia/reperfusion injury, MIRI)是冠心病心肌梗死溶栓和介入治疗的重要病理生理过程。失控的炎症反应是MIRI损伤的重要特征。心肌微血管内皮细胞(Cardiac microvascular endothelial cells, CMEC)是心脏微循环的重要组成部分,也是MIRI过程中最先波及且最先受损的部位,因此在MIRI损伤机制中发挥着重要作用。Toll样受体4(TLR-4)为体内模式识别受体Toll样受体家族的主要成员,由于能够识别多种内源性和外源性配体,不仅可介导感染性炎症反应,在非感染性炎症反应中也发挥着重要作用。近年来TLR-4在MIRI中的作用也受到越来越多的关注。最新的研究表明:TLR-4基因缺陷小鼠(C3H /HeJ小鼠)与野生型小鼠(C3H/HeN小鼠)相比MIRI后的心肌梗死面积明显减少。进一步研究也证实,给予TLR-4特异性抑制剂eritoran阻断TLR-4信号通路能够对小鼠MIRI起到保护作用。因此,我们推测TLR-4信号通路可能参与了MIRI的炎症反应。但是,目前的研究主要集中于TLR-4信号通路在心脏组织水平以及心肌细胞I/R损伤中的作用,而在CMEC I/R损伤中的作用尚无报道。因此,本研究试图通过以下方法:1、体外分离培养CMEC;2、建立缺氧/复氧(H/R)模型,模拟I/R损伤;3、观察H/R损伤中TLR-4信号通路的变化;4、观察应用TLR-4中和性抗体阻断TLR-4信号通路是否对CMEC I/R损伤具有保护作用,探讨TLR-4信号通路在CMEC MIRI损伤中的作用。实验方法第一部分:CMEC的分离、培养及缺氧复氧模型的建立无菌条件下取出大鼠心脏,利用化学消化法成功分离CMEC。用含15%胎牛血清(FCS)的DMEM培养液维持培养。取2-3代的CMEC缺氧6h后,分别复氧2 h、12 h及24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞的增殖能力;Hochest染色检测细胞凋亡;硝酸还原法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)分泌量;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。第二部分:TLR-4信号通路在CMEC缺氧复氧损伤中的变化取体外培养2-3代的CMEC缺氧6 h后,分别复氧2 h、12 h及24 h。收集细胞培养液,并裂解细胞,获得CMEC蛋白。用Western blot方法检测细胞TLR-4及NF-κB蛋白表达水平。用ELISA试剂盒检测培养液中炎性因子IL-6、TNF-α分泌水平。第三部分:抑制TLR-4信号通路对CMEC缺氧复氧损伤的保护作用取体外培养2-3代的CMEC,给予TLR-4中和性抗体MTS510(10ug/ml) 37℃孵育2h后给予H/R处理。缺氧6 h后复氧2h,再次用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞的增殖能力;用Hochest染色检测细胞凋亡;硝酸还原法测定细胞培养液中NO分泌量;利用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。实验结果1.体外成功分离、培养大鼠CMEC。2.与正常对照组相比,经过H/R损伤后,各组CMEC的增殖均明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05);CMEC的NO分泌能力及迁移能力均显著下降(P<0.05)。3.与正常对照组相比,TLR-4蛋白水平在复氧后2 h及12 h明显升高(P<0.05),24 h基本恢复正常;NF-κB蛋白水平在复氧2 h、24 h显著高于对照组(P<0.05);而CMEC在复氧2 h、12 h及24 h后分泌的IL-6和TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)。4.通过特异性中和性抗体阻断TLR-4信号通路,CMEC在缺氧6h复氧2h后,与单纯H/R处理组相比,增殖能力显著增加(P<0.05),细胞凋亡率下降(P<0.05);细胞迁移能力提高(P<0.05);NO分泌能力以及eNOS表达水平显著增加(P<0.05)。结论1. H/R损伤可以导致CMEC增殖能力下降,凋亡增加,并导致细胞迁移能力、NO分泌下降等功能障碍。2.在H/R早期,TLR-4/NF-κB信号通路激活,导致下游炎性因子IL-6、TNF-α分泌的增加,从而参与CMEC的炎症反应。3.通过特异性中和抗体抑制TLR-4/NF-κB信号通路,可以减少H/R诱导的CMEC凋亡及功能障碍,对CMEC的H/R损伤具有保护作用。