背景:肾细胞癌是一种较为常见的泌尿系统恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的3%和所有肾脏恶性肿瘤的90%。在中国,根据赫捷院士等人的统计,2015年新发肾癌病例66800例,死亡23400例。因肾细胞癌富血管的特点,其对于化疗和放疗缺乏敏感性,当前主要的治疗方式为手术治疗和靶向药物治疗。因对肾细胞癌发生发展的准确分子机制尚不完全清楚,探究其病理发生机制很有意义,能够指导临床诊断、药物治疗和术后监测。MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA,长度一般约为20-24nt。其主要在转录后水平通过调控靶基因的信使RNA(messengerRNA mRNA),与其3’非翻译区(3’-Untranslated Region,3’-UTR)的特定序列结合来发挥作用。根据其与mRNA转录本的互补序列结合紧密程度,可以直接降解靶基因mRNA或抑制其翻译蛋白,从而阻止特定靶基因的表达。目前关于miRNA与肾细胞癌之间作用机制的研究文献很多,证实其通过不同的途径参与到肾细胞癌的发生、进展转移等各阶段。目的:从临床收集肾细胞癌组织标本,在实验室培养经典肾细胞癌细胞株进行研究,用荧光定量PCR法分别检测组织和细胞内的miR-362-3p表达情况,从表观遗传学角度进一步探索miR-362-3p表达异常的内在机制。通过多种细胞功能实验了解miR-362-3p在肾细胞癌细胞系786-0和ACHN中的生物学功能。利用生信知识和在线数据库筛查miR-362-3p的可能作用靶点,荧光素酶报告基因分析系统鉴定靶序列。通过对靶基因的生物学功能分析,RNA干扰实验探索基因的下游信号通路,证明miR-362-3p对于靶点具有调控功能。方法:1)在25例肾切除标本中检测肿瘤组织和癌旁组织中miR-362-3p的相对表达量,利用统计方法分析miR-362-3p在配对各组中的表达水平差异;探究miR-362-3p的基因是否存在表观遗传学修饰,如启动子区的高甲基化,利用甲基化抑制实验证实与miR-362-3p表达异常间的关系;2)在肾细胞癌细胞株中转染miR-362-3p模拟体(mimic),将miR-362-3p表达量进行上调。利用转染后的细胞完成多项获得性功能实验,了解miR-362-3p过表达后对于肾细胞癌的增殖、周期、体内体外成瘤、侵袭等能力的影响。实验内容包括:细胞活力检测CCK-8、平板克隆形成、裸鼠皮下荷瘤、细胞流式周期、Transwell 等方法;3)通过多个在线生信数据库筛选miR-362-3p的直接作用的靶基因。然后分别采用定量PCR法及Western Blot技术在mRNA和蛋白两个层面分析靶基因表达情况;对靶基因的种子序列通过荧光素酶双报告实验加以进一步证实;最后通过RNA干扰技术明确下游信号通路及靶向调控机制。结果:1)在肾细胞癌中miR-362-3p表达水平降低。在25组配对的肾细胞癌组织和癌旁组织标本,以及三株肾细胞癌细胞系786-0,ACHN和Caki-1中分别用荧光定量PCR检测了 miR-362-3p的表达水平。结果提示与癌旁组织比较miR-362-3p在肾细胞癌组织中的表达量呈显著下调。与正常肾小管上皮细胞HK-2比较,miR-362-3p在三株肾细胞癌细胞株中的表达量也显著下调。2)硫化测序PCR(BSP)提示在肾癌细胞株786-0、ACHN和Caki-1中,miR-362-3p的启动子区的CpG岛处于高甲基化水平。对细胞株利用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷处理96h并荧光定量PCR法测定,发现miR-362-3p的表达水平明显提高。3)多项获得性功能细胞实验表明上调miR-362-3p的表达对肾细胞癌细胞的增殖、周期、平板克隆形成和裸鼠成瘤能力起抑制作用。除此之外,过表达miR-362-3p能负向调节细胞的迁移侵袭能力,阻止上皮间质转化(EMT),其下游信号通路为AKT/FOX03a。4)本实验采用两步法来筛查miR-362-3p可能的靶向基因:第一步通过在线生物信息学数据库进行基因预测,第二步是经典荧光素酶报告基因系统进行验证,最终发现SP1是miR-362-3p的直接的作用位点。5)利用小RNA干扰技术下调SP1的表达量,通过细胞功能实验观察细胞的增殖、周期和迁移侵袭能力的变化,发现均受到抑制,AKT/FOX03a通路相关蛋白表达量下降,其和miR-362-3p在肾细胞癌中的功能和下游通路具有一致性。结论:1)肾细胞癌组织中miR-362-3p的表达量显著下调,考虑其启动子区的CpG岛高度甲基化所致。2)上调miR-362-3p的表达对肾细胞癌细胞的增殖、周期、体内体外成瘤和迁移侵袭能力具有抑制作用。同时,miR-362-3p可以调控AKT/FOX03a信号通路。3)SP1是miR-362-3p的直接作用靶点,可通过调节AKT/FOX03a信号通路来抑制肾细胞癌的发生和进展。