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目的:研究调节肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAMs)的自噬状态对共培养胃癌细胞放射敏感性的影响并探讨其可能机制,为胃癌的放射增敏研究提供新的思路;通过观察自噬调节预处理的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与胃癌细胞混合接种裸鼠的生长情况及移植瘤的放射敏感性,初步探索通过调控TAMs自噬状态影响肿瘤放射治疗效果的可能性。方法:(一)通过选择激活途径使用佛波酯(PMA)、人重组白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)激活人单核细胞THP-1分化为Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)后,采用流式细胞术鉴定选择激活途径激活所得细胞表面CD68、CD204、CD206标志性分子表达情况;分别用不同自噬调节剂雷帕霉素(Rapamycin)和巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)干预其自噬,MDC(Monodansylcardeverine)荧光染色法、Lyso-Tracker Red和Mito-Traker Green免疫荧光标记法检测线粒体和溶酶体的表达、免疫荧光检测自噬标记性蛋白MAP1 LC3及透射电镜观察自噬调控剂作用后各组Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞自噬的发生情况。(二)采用非接触共培养方式将自噬上调组Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞、空白实验组、自噬下调组Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞与人胃癌MGC803细胞共同培养48h。检测辐照前后自噬调节剂对共培养胃癌MGC803细胞放射反应能力的表达情况,MDC荧光染色法、Lyso-Tracker Red和Mito-Traker Green免疫荧光标记法检测线粒体和溶酶体的表达、免疫荧光检测自噬标记性蛋白LC3及透射电镜观察自噬调控剂调节各组Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞自噬并辐照后胃癌MGC803细胞自噬的表达情况。应用Western Blot技术分别对各组胃癌细胞相关蛋白caspase 3、7,cathepasin B、D、E、L进行检测。(三)在体外实验基础上,利用雷帕霉素与巴弗洛霉素A1分别对TAMs进行自噬上调与下调,按照3:1的比例与MGC803胃癌细胞混合接种于BALB/c裸鼠,观察各种成瘤率、成瘤时间,瘤体体积变化与小鼠体重改变,并对成瘤裸鼠进行局部外照射,比较各组受照后小鼠体重与瘤体体积变化及照后7d瘤体重量,并通过HE染色、免疫组化等方法观察照后病理改变及相关蛋白表达变化。结果:(一)人单核细胞白血病细胞THP-1在通过佛波酯(PMA)、人重组白介素-4(IL-4)依次序贯作用总计72h小时后,检测所得贴壁细胞表面CD68、CD204、CD206的表达水平,流式细胞检测显示经上述2种药物作用后所得的细胞表面CD68、CD204、CD206表达皆高于未经处理的THP-1细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。针对Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞自噬水平的LC3免疫荧光及自噬囊泡(Autophagic Vacuoles,AVs)荧光蛋白染色检测结果显示:经过一定浓度自噬上调控剂作用后的Ⅱ型肿瘤相关巨噬细胞自噬标志性蛋白MAP1 LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)在撤除干预药物48h后仍然有显著表达。结合MDC染色实验结果,Lyso-Tracker Red及Mito-Traker Green免疫荧光双标记法的检测结果,在预处理之后的M2-TAMs自噬状态的维持可持续一段时间,可以作为共培养的研究试剂使用。(二)经一定剂量(4gy)照射后,MGC803细胞与不同自噬状态M2-TAMs共培养,克隆形成实验显示自噬上调组克隆形成数最多,自噬下调组克隆数最少;在放射敏感性方面,M2-TAMs细胞自噬上调促进了MGC803细胞的克隆形成率,抑制其凋亡,M2-TAMs自噬下调对MGC803细胞的影响则相反,抑制M2-TAMs自噬有望提高共培养体系中胃癌细胞的放射敏感性。M2-TAMs自噬改变,对肿瘤相关蛋白的表达也产生显著影响,自噬上调组的cathepsin、B、D、E基因表达上调,而caspase-3、7以及cathepsin L表达下调,自噬下调组为cathepsin、B、D、E表达下调,而caspase-3、7以及cathepsin L表达上调。(三)在体外实验基础上,我们建立胃癌移植瘤裸鼠模型;TAMs自噬上调组肿瘤体积最大、瘤体最重,自噬上调组COX-2,PD-L1,TNF-α表达最强,PTEN表达最弱。而自噬下调组肿瘤最小,瘤体最轻,COX-2,PD-L1,TNF-α表达最少,辐照后自噬下调组明显抑制COX-2,PD-L1,TNF-α表达,而促进PTEN表达。结论:上调TAMs自噬水平,可降低共培养胃癌细胞的放射敏感性,而抑制TAMs自噬,可增加共培养胃癌细胞的放射敏感性;肿瘤微环境中TAMs自噬的调节状态,可能是肿瘤放射抵抗的机制之一,抑制TAMs的自噬,有望增加肿瘤的放射敏感性,提高肿瘤放疗效果,值得进一步深入研究。