论文部分内容阅读
流感病毒属正粘病毒科,根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原性及其基因特性不同分为A、B、C型。流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,临床表现为发热、头痛、肌痛、乏力、鼻炎、咽痛和咳嗽。流行性感冒是威胁人类健康的重要传染病之一,全球每年约有10%-20%的人感染流感病毒,约300-500万人会产生严重症状,并可导致约25-50万人死亡。接种流感疫苗是预防流感疾病发生、流行的最有效手段。目前使用的流感疫苗主要是针对A型流感病毒的H1N1亚型、H3N2亚型以及B型流感病毒的三联灭活疫苗,此疫苗主要是针对流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。由于它们经常发生抗原漂移和抗原转变,抗原性频繁发生变异,因此制备疫苗的病毒株需要经常更换,人们不得不年年接种新的流感疫苗。与HA和NA不同,流感病毒膜蛋白M2的氨基酸序列非常保守,特别是其氨基端的10个氨基酸,在人流感和禽流感病毒中几乎完全相同。此外,M2蛋白胞外区的抗血清具有抑制流感病毒复制的功能,提示其可能作为广谱流感疫苗的成份。M2蛋白胞外区(M2 extracellular domain, M2e)由24个氨基酸残基组成,因而免疫原性较弱。为刺激产生较强的免疫反应,可以通过基因重组方法将M2e与一种佐剂蛋白融合表达。常用的佐剂包括霍乱毒素(Cholera toxin, CT)以及大肠杆菌不耐热毒素(Heat-labile enterotoxin, LT), CT和LT同属A-B型细菌蛋白毒素家族,都由A、B两种亚单位组成。为避免毒性,人们将B亚单位作为佐剂与目的蛋白重组,但是其佐剂效应会相应下降。另一种蛋白佐剂铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)结构的特点在于它的结构功能区在单一肽链上,行使其细胞毒性所必需的细胞结合、转位和ADP-核糖基化这三种功能。铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)是由假单胞菌属铜绿假单胞菌分泌的细胞毒性外毒素；成熟的PEA分子由613个氨基酸组成。X线衍射晶体分析表明,PEA含3个不同结构域：Ⅰ区是PEA的受体识别功能结构域,包括Ⅰa区和Ⅰb区；Ⅱ区为跨膜区；Ⅲ区为细胞毒性区。Ⅰb与PEA的生物学活性无明显关系。研究表明,将PEA序列上的第553位谷氨酸缺失后,PEA会丧失ADP核糖基酶活性,变成无毒性形式(ntPE),但突变毒素仍能与天然毒素竞争结合靶细胞上的受体。ntPE具有较强的免疫原性,是一种良好的蛋白佐剂。本论文构建了两种含有甲型流感病毒M2e与铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)融合的原核表达载体,包括单拷贝pET/ntPE-M2e和三拷贝pET/ntPE-3M2e,并分别在大肠杆菌表达了融合蛋白。用纯化的融合蛋白分别通过皮下及鼻腔接种途径免疫小鼠,然后用流感病毒攻击,观察这两种融合蛋白对小鼠的抗流感病毒免疫保护作用。本研究包括五个部分：1、铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆与突变通过PCR方法扩增得到铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)的基因,经DNA测序确证。将PEA基因克隆到T载体上。设计两对引物应用PCR方法将PEA基因的第553位谷氨酸的密码子缺失,使其丧失毒性,从而获得了无毒性的PEA突变基因(ntPE)。2、pET/ntPE-M2e和pET/ntPE-3M2e表达载体的构建及其表达通过对甲型流感病毒M2蛋白胞外区基因序列对比和分析,选择了23个保守氨基酸,化学合成其基因序列。然后用合成的M2e编码区替换ntPE基因中的非必需区Ⅰb,得到单拷贝M2e表达载体pET/ntPE-M2e。此外我们还将PEAⅠ、Ⅱ区的基因序列与3个串联的M2e基因重复序列连接,得到了三拷贝表达载体pET/ntPE-3M2e。将上述两种表达载体转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达。结果两种蛋白均获高效表达,表达产物以包涵体形式存在。Western blot确证了两种表达产物均具有M2e蛋白的抗原性。3、两种ntPE-M2e融合蛋白的免疫原性的研究将上述两种蛋白通过SDS-PAGE电泳后胶回收方法进行纯化,然后与福氏不完全佐剂混合,皮下注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。共免疫3次,每次间隔3周,免疫剂量为100μg／只。动物随机分为三个组：包括PBS组,ntPE-M2e组和ntPE-3M2e组。采集动物血清作ELISA和动物脾细胞作ELISPOT,检测的结果表明免疫组均可诱导小鼠产生抗M2e的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,抗体滴度随加强免疫次数增加而增高。末次免疫2周后,以5个LD50流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株鼻内接种感染实验小鼠。病毒攻击后2周内,每日观察小鼠生存及体重变化。结果表明,免疫组小鼠对病毒的致死性攻击有较强保护作用。攻毒5天后每组处死5只小鼠,无菌取肺,检测肺组织病毒载量。结果表明免疫组小鼠肺内病毒复制受到明显抑制。4、带His标签的两种ntPE-M2e融合蛋白表达载体的构建、表达及其纯化为了便于纯化,我们在上述两个表达载体的基础上通过PCR方法添加了His标签基因序列,得到pET/ntPE-M2eH和pET/ntPE-3M2eH两个表达载体,分别转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达,结果两种蛋白均获得高效表达,表达产物仍以包涵体形式存在。将包涵体变性裂解后用镍离子亲和柱纯化,Western blot证实了两种蛋白的抗原性。5、带His标签的两种ntPE-M2e融合蛋白的免疫原性的研究将纯化的两种融合蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周,免疫剂量为40μg／只。根据抗原和免疫方式不同分为6组,分别为PBS／皮下、PBS／粘膜、ntPE-M2eH/皮下、ntPE-M2eH/粘膜、ntPE-3M2eH/皮下和ntPE-3M2eH/粘膜组。皮下免疫使用氢氧化铝佐剂,鼻内接种不使用佐剂。采集动物血清作ELISA和动物脾细胞作ELISPOT实验的结果表明皮下免疫组和粘膜免疫组均可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应。末次免疫两周后,以40 LD50流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株对实验小鼠进行攻击。病毒攻击2周内,每日观察小鼠生存及体重变化。结果表明,皮下免疫组小鼠对病毒的致死性攻击有较强保护作用,而粘膜免疫组小鼠没有保护。攻毒5天后每组处死5只小鼠,无菌取肺,并检测肺组织病毒载量,结果表明皮下免疫组小鼠肺内病毒复制受到明显抑制,粘膜免疫组小鼠肺内病毒复制抑制作用不明显。我们进而又实验了不同剂量的抗原蛋白鼻内接种免疫对小鼠的保护作用。使用6周龄雌性BALB/c小鼠,共免疫2次,间隔2周。根据免疫蛋白和剂量的不同,将实验动物分为10组,分别是PBS、ntPE-M2eH/0.4μg、ntPE-M2eH/2μg、ntPE-M2eH/10μg, ntPE-3M2eH/0.4μg、ntPE-3M2eH/2μg、ntPE-3M2eH/10μg、ntPE/0.4μg、ntPE/2μg和ntPE/10μg。取免疫动物的血清和脾脏分别做ELISA和ELISPOT实验,结果表明,ntPE-M2eH和ntPE-3M2eH通过鼻内接种途径均可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应。末次免疫两周后,以4 LD50流感病毒A/PR/8/34(H1N1)对实验小鼠进行攻击,每日观察小鼠生存及体重变化。结果表明,ntPE-3M2eH/0.4μg组对流感病毒的保护率达到60%, ntPE-3M2eH/2μg组和ntPE-M2eH/2μg组对流感病毒的保护率为10%,其他组均于2周内全部死亡综上所述,本研究以铜绿假单胞菌外毒素A作为蛋白佐剂,构建了含有甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)的融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌表达了相应的融合蛋白,并建立了表达产物的纯化技术。将纯化的融合蛋白采取不同接种途径免疫BALB/c小鼠,结果表明这些融合蛋白均能诱导机体产生较强的针对M2e的细胞免疫和体液免疫应答。病毒攻击实验表明皮下免疫途径可有效地保护小鼠对抗流感病毒A/PR/8/34的攻击,鼻内免疫途径在剂量适当时可以在一定程度上缓解感染流感病毒PR8株后的症状并具有一定的保护作用。本研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了良好的基础。