动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一种主要累及大、中动脉的慢性炎症性疾病，以大量脂质堆积在内膜下为特征。渗透到内膜下的巨噬细胞吞噬脂质转变为泡沫细胞后其运动能力显著降低，进而囤积在内膜下导致粥样斑块和脂质坏死核心形成。蛋白质的糖基化修饰对蛋白的折叠、稳定和功能具有重要影响。那么泡沫细胞运动能力减弱导致其滞留斑块内是否与关键蛋白糖基化修饰水平改变存在关联？本文利用溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）诱导Raw264.7巨噬细胞和小鼠原代腹膜巨噬细胞形成泡沫细胞为模型，观察泡沫细胞运动能力的改变。进一步通过流式细胞术、免疫荧光和WB等技术检测泡沫细胞形成前后蛋白糖基化修饰水平和糖基转移酶的变化；通过双荧光素酶报告实验、EMS A和C hip等实验探讨糖基转移酶改变的的分子调控机制。研究结果显示：①200μM的LPA作用24 h能够促进巨噬源性泡沫细胞的形成；②巨噬源性泡沫细胞运动能力的下降与岩藻糖基转移酶8（fucosyltransferase8,Fut8）表达量的下降呈正相关；③动物实验结果显示动脉粥样硬化斑块的消退过程伴随着斑块内的Fut8含量的上升；④LP A通过降低HNF1α与Fut8启动子的结合从而下调F ut8基因转录水平。我们的实验表明F ut8表达水平下降是导致巨噬源性泡沫细胞运动能力减弱，滞留斑块的关键因素之一。提示F ut8可能是以后开发防治动脉粥样硬化新药物的作用靶标之一。　　第一部分 LP A导致巨噬源性泡沫细胞的形成　　目的：以R aw264.7巨噬细胞为研究对象，利用高浓度LP A构建新的泡沫细胞模型并初步探讨其机制，为后续实验提供细胞模型。　　方法：　　1.利用CC K8实验检测LP A对R aw264.7巨噬细胞存活率的影响。　　2.采用油红 O染色实验和胆固醇酯测定实验检测 LP A处理后R aw264.7巨噬细胞内脂滴形成情况和胆固醇酯比例。　　3.利用WB和RT-PCR检测LPA处理Raw264.7巨噬细胞后脂质摄取、外排相关受体和胆固醇合成酶的表达情况，观察LP A对脂质平衡的影响。　　4.检测LPA1和LPA3受体（LPA1,3受体）的激活情况，利用LPA1,3受体抑制剂处理细胞后观察其对泡沫细胞形成的影响。　　5.检测LP A处理后AKT信号通路的激活状态，并给予抑制剂后观察下游受体表达情况和泡沫细胞形成情况。　　结果：　　1.LPA浓度在200μM、作用24 h时对Raw264.7细胞的存活率无显著性影响。　　2.LPA浓度在200μM、作用24 h时，Raw264.7巨噬细胞内脂滴数量明显增加和胆固醇酯比例升。表明泡沫细胞模型建立成功。　　3. WB和RT-PCR结果显示LPA处理Raw264.7巨噬细胞后介导脂质摄入的SRA受体明显上调；介导脂质外排的ABCA1和SRBI受体明显下调；而脂质合成的限速酶HMGCR无明显变化。表明LPA可能通过促进脂质摄取，抑制脂质外排从而造成胞内的脂滴囤积。　　4. LPA处理Raw264.7巨噬细胞后，LPA1和LPA3受体明显激活。给予10μMLPA1,3受体抑制剂（Ki16425）预处理1h后，细胞囤积的脂滴数量明显减少。表明LPA1,3受体参与了LPA诱导泡沫细胞形成的过程。　　5.AKT信号通路在LPA处理细胞后被激活，且60 min时达到最高点。R aw264.7巨噬细胞给予Ki16425预处理后，激活的AKT信号通路明显被抑制。表明 LP A能够通过其受体激活下游的 AKT信号通路。　　6.给予AKT通路抑制剂MK2206处理R aw264.7巨噬细胞后，AKT的激活受到明显抑制。MK2206预处理细胞1 h后细胞内的脂滴含量明显减少，脂质外排受体S RBI受体含量上升。　　结论：LPA通过激活胞膜上LPA1,3受体，导致胞内AKT活化，从而下调S R BI的表达，造成脂质外排受阻，诱导巨噬细胞向泡沫细胞的转化。　　第二部分 F ut8对巨噬源性泡沫细胞运动迁移能力的影响　　目的：探索泡沫细胞形成过程中蛋白糖基化修饰水平和糖基转移酶的变化；进一步明确糖基转移酶含量下降和泡沫细胞运动能力减弱之间的联系。　　方法：　　1.利用 trans well和划痕实验检测巨噬源性泡沫细胞运动能力的改变。　　2.采用WB、RT-PCR、流式细胞术、凝集素Blot和免疫荧光等方法筛选 LP A处理 R aw264.7巨噬细胞前后变化最明显的糖基化修饰类型和糖基转移酶。　　3.采用siRNA技术敲低Fut8表达，利用transwell和划痕实验检测泡沫细胞运动能力的改变。　　4.构建质粒过表达F ut8模型，利用trans we ll和划痕实验检测泡沫细胞运动能力的改变。　　5.提取小鼠腹膜原代巨噬细胞，重复上述实验的关键步骤。　　结果：　　1. Transwell实验显示LPA处理Raw264.7巨噬细胞穿透到下室的细胞数量明显减少;划痕实验结果显示细胞的迁移速度明显减慢;小鼠腹膜原代巨噬细胞经过LP A处理后，观察到同样的结果。表明LP A诱导形成的巨噬源性泡沫细胞运动能力明显减弱。　　2.流式细胞术结果显示LP A处理R aw264.7巨噬细胞后，S NA（α-2,6唾液酸化修饰）和MAL I（α-2,3唾液酸化修饰）平均荧光强度（mean fluorescence intensity; MFI）未见明显改变；凝集素Blot也显示蛋白的α-2,6唾液酸化和α-2,3唾液酸化修饰水平未见变化。表明LPA处理细胞后蛋白的唾液酸化修饰水平无改变。流式细胞术和凝集素Blo t结果显示LP A处理R aw264.7巨噬细胞后AAL（总岩藻糖基化修饰）平均荧光强度和蛋白总岩藻糖基化修饰水平在明显下降。说明总岩藻糖基化修饰水平在泡沫细胞形成后存在显著下降。　　3. RT-PCR结果显示LPA处理Raw264.7巨噬细胞后Fut7和Fut8的mR NA水平明显降低；流式细胞术结果显示LP A处理细胞后LC A（α-1,6岩藻糖基化）荧光强度明显下降，而LTL（α-1,3/4岩藻糖基化）的荧光强度未见显著变化。因此后续实验将重点关注蛋白α-1,6岩藻糖基化修饰。WB和免疫荧光实验结果显示Fut8和α-1,6岩藻糖基化修饰水平在LP A处理后显著降低。LP A处理小鼠原代腹膜巨噬细胞后，Fut8蛋白和mRNA含量均明显下降。表明LPA诱导泡沫细胞形成过程中显著抑制了Fut8表达和其介导的α-1,6岩藻糖基化水平。　　4. Raw264.7巨噬细胞转染 Fut8 siRNA后，细胞内 Fut8蛋白和mRNA含量均显著下降，表明Fut8基因敲低模型构建成功。预先干扰Fut8后：transwell实验结果显示穿透到下室的细胞数量较只给予LPA处理组更少;划痕实验结果显示细胞的迁移速率较只给予 LP A处理组更慢。　　5. Raw264.7巨噬细胞转染pcDNA3.1-Fut8过表达质粒后，细胞内Fut8蛋白和mRNA含量均显著上升，表明Fut8基因过表达瞬转模型构建成功。预先过表达F ut8后：trans we ll实验结果显示穿透到下室的细胞数量较只给予LP A处理组明显增多；划痕实验结果显示细胞迁移速率较只给予LP A处理组显著加快。　　结论：巨噬源性泡沫细胞的运动能力减弱与泡沫细胞形成过程中F ut8表达量下降正相关。　　第三部分 F ut8表达变化与动脉粥样硬化斑块形成的关系　　目的：在动物体内验证动脉粥样硬化斑块发生、发展过程中F ut8的表达变化情况。　　方法：给予18只雄性Ap o E-/-小鼠高脂饲料喂养，建立动脉粥样硬化动物模型。其中基线组（Baseline组，6只）喂养12周后处死取材；斑块进展组（Control组，6只）继续高脂喂养4周，同时灌胃给予生理盐水；斑块消退组（Rosuvastatin组，6只），同时灌胃给予瑞舒伐他汀（10mg/kg/天）。常规生化分析三组小鼠血清中的甘油三酯　　（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholestero l，HDL-C）水平；HE染色判断主动脉根部内膜厚度；冰冻切片油红O染色判断主动脉根部斑块面积大小，明确AS模型的建立、发展和消退情况。最后通过免疫组化染色检测斑块进展和消退组主动脉根部斑块中F ut8含量的变化。　　结果：　　1.与基线组相比，斑块进展组的血清中T C、TG和LDL-C水平明显升高，而给予药物治疗后上述指标显著降低。主动脉根部HE染色结果显示斑块进展组的内膜厚度较基线组增厚，药物治疗后斑块消退组的内膜厚度明显变薄；油红O染色结果显示斑块进展组的主动脉根部斑块面积明显大于基线组，药物治疗后斑块消退组的斑块面积减小。上述实验证实动脉粥样硬化发生、发展和消退模型构建成功。　　2.免疫组化染色结果显示药物处理后，斑块消退组内的F ut8含量明显升高。　　结论：F ut8的表达与动脉粥样斑块的形成呈负相关。　　第四部分 Fut8表达下调的分子机制　　目的：以R aw264.7巨噬细胞和293T细胞为研究对象，进一步探讨F ut8表达下调的分子机制。　　方法：　　1.采用WB和RT-PCR实验检测LPA1,3受体对Fut8表达的影响。　　2.给予蛋白合成酶抑制剂CHX（cycloheximide，CHX）和RNA合成酶抑制剂AMD（actinomycin D，AMD）后，明确LPA对Fut8基因转录水平的调节。　　3.利用双荧光素酶报告实验和启动子截短的方法，检测LP A对F ut8启动子活性的影响以及作用的启动子区域。　　4.检测LP A处理后HNF1α的变化情况。　　5.利用EMSA和Chip实验证实HNF1α与Fut8启动子存在相互作用，并受到LP A的调节。　　6.过表达HNF1α后检测其对F ut8表达的影响。　　结果：　　1.抑制LPA1,3受体后，LPA下调的Fut8的蛋白和mRNA表达得到明显恢复。表明LP A通过激活其受体下调Fut8的表达。　　2.给予蛋白合成酶抑制剂CHX后，CHX+LPA组与CHX组比较发现F ut8的蛋白水平未见明显改变，表明LP A未影响F ut8的蛋白降解过程（稳定性），证实 LP A通过减少 F ut8的蛋白合成（来源）导致Fut8蛋白水平下降。给予RNA合成酶抑制剂AMD后，AMD+LPA组与AMD组比较发现Fut8的mRNA水平未见明显下降，表明LPA不影响Fut8的mRNA的降解过程（稳定性），证实LPA通过减少Fut8的mRNA合成（来源）导致Fut8的mRNA水平下降。上述实验表明LPA下调F ut8的表达是通过影响Fut8的基因转录水平发挥作用。　　3.双荧光素酶报告实验显示LP A处理293T细胞后，F ut8的启动子活性明显减弱。通过截短启动子构建包含不同长度的启动子片段的载体后，我们发现-643/-411区域最为重要。表明LP A通过减弱F ut8的启动子活性从而导致Fut8转录活性下降。　　4. WB和RT-PCR实验结果显示细胞总的HNF1α蛋白水平在LPA处理Raw264.7巨噬细胞后明显下降。通过提取胞核和胞浆蛋白，WB试验显示 LPA处理细胞后胞浆和胞核内的 HNF1α也存在下降，且胞核内下降更为明显。表明HNF1α收到LP A的调控。　　5. EMSA实验发现LPA处理Raw264.7巨噬细胞后，生物素化的DNA探针与 HNF1α之间的结合较对照组明显减少。C hip实验发现HNF1α单克隆抗体与F ut8启动子之间的结合在LP A处理细胞后明显减少。上述实验表明LP A能够减弱HNF1α与F ut8启动子之间的结合。　　6. Raw264.7巨噬细胞过表达HNF1α后，Fut8的蛋白和mRNA水平得到明显的恢复。表明HNF1α与Fut8的表达存在直接的调控。　　结论：LP A通过下调HNF1α与F ut8启动子的结合，从而下调F ut8的转录活性，导致其表达减少。