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背景:心肌纤维化(Myocardial Fibrosis)是由于心肌成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过度沉淀、心肌硬度增加等而引起的心脏功能失调的一种病理性现象,一般是在高血压、心肌缺血以及瓣膜性心脏病等心血管疾病的基础上形成。心肌纤维化的发生是左心室舒张功能异常的主要影响因素,也是心源性猝死的危险因素之一。病理学研究表明,心肌纤维化表现为心肌胶原蛋白的过度积累,血管周围的纤维组织向心肌周围弥散性分布,并最终引起心力衰竭。研究发现,心肌纤维化的发生与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的异常相关,且涉及炎性反应、氧化应激反应、内皮细胞功能失调、细胞内钙离子浓度异常以及细胞因子的异常。然而,由于其复杂的发病机制,目前临床上对于心肌纤维化尚无统一有效的治疗方式。凝血酶(Thrombin)是一种由凝血酶原裂解而来的丝氨酸蛋白酶。凝血酶除了参与机体正常的凝血过程,还是血小板的重要激活物,其参与血小板活性和炎症反应。正常组织中,凝血酶具有促炎和促纤维化作用,而在一些病理状态下,例如组织纤维化、血管新生以及血栓等情况下,凝血酶表现较高的活性。因此,有效调控凝血酶的活性对于心肌功能异常类疾病的治疗具有潜在意义。凝血酶在细胞外发挥调控作用的主要作用机制是通过激活细胞表面的蛋白酶激活受体(Protease-activatedreceptors,PARs),进而活化效应细胞的胞内信号通路,调控细胞的增殖、代谢等过程。PAR存在于许多组织和细胞中,可介导肿瘤的生长和细胞的凋亡。研究报道,PAR-1作为PAR受体家族成员之一,可介导多种炎症反应、肿瘤侵袭和血管生成等。且在心肌纤维化过程中,PAR-1的表达显著升高,进而促进心肌成纤维细胞的活化和胶原蛋白合成的增加。此外,PAR-1作为凝血酶的主要受体之一,可通过结合多条细胞内信号转导通路并促进其活化,进而参与调控多种细胞类型的反应。G蛋白(Gprotein)是多种信号途径的重要蛋白,在细胞跨膜信号传导中起着重要作用。Gq蛋白是G蛋白的一种,Gq蛋白是PAR-1受体下游重要的效应蛋白之一,在多种信号通路的活化中发挥调控作用。此外,Gq蛋白还可耦联多种受体,促进Gq蛋白的活化,进而促进细胞内钙离子向胞浆释放,从而激活蛋白酶C(Protein kinase C,PKC)产生生物效应。PKC介导的信号通路在纤维化发展进程中调控成纤维细胞的胞内事件。在凝血酶引起的心肌纤维化中,不同的PKC亚型在细胞增殖及DNA合成中均发挥重要作用。新型抗凝药是一种重要的靶向药物,它通过直接降低凝血酶活性进而抑制血栓的形成。该药物具有目的性强、对身体副作用较小等特点,在临床治疗中具有较大的前景。新型抗凝药的作用机制是通过抑制凝血级联中的两个重要靶点Xa和Ila。其中,凝血因子Xa作为外源性凝血途径和内源性凝血途径的重要交汇点,其发挥作用时,凝血因子首先通过在磷脂膜表面形凝血酶复合物,进而激活凝血酶原向凝血酶转变的信号,促进凝血酶的合成。阿哌沙班(Apixaban)是基于Xa研发出的一种重要新型抗凝药,是直接Xa因子抑制剂,它可通过与Xa因子的活性位点结合,阻止凝血酶原转变为凝血酶,减少凝血酶的合成,从而发挥抗凝作用。然而阿哌沙班作为临床上常用的新型口服抗凝药之一,是否可以通过改变凝血酶的活性介导心肌纤维化的发展尚无报道。基于以上背景,本研究首先建立缺血诱导的心肌纤维化小鼠模型,并给于不同浓度的阿哌沙班处理,同时设置贝那普利(Benazepril)阳性对照组和假手术(Sham surgery)组;检测阿哌沙班对小鼠心脏血压、心肌指数、胶原蛋白储备、凝血酶活性以及PAR-1表达的影响,以此评估阿哌沙班对小鼠心肌纤维化的影响。体外实验利用凝血酶处理心肌成纤维细胞,研究阿哌沙班对心肌成纤维细胞胶原蛋白存储的影响并探讨其作用机制。最后,本研究利用关键分子Gq和PKC的抑制剂预处理凝血酶诱导的心肌成纤维细胞,在细胞水平验证阿哌沙班改善心肌纤维化的机制;此外,本研究再次构建心肌纤维化小鼠模型,体内验证阿哌沙班改善心肌纤维化的作用机制。本文旨在探讨阿哌沙班对心肌纤维化的保护机制,为阿哌沙班的临床应用提供充足的理论基础。目的:本研究首先考察阿哌沙班对心肌纤维化小鼠心肌功能的保护效应以及对胶原蛋白沉积和凝血酶活性的影响。其次从细胞及分子水平探讨阿哌沙班保护心肌纤维化的分子机制。最后通过体内实验进一步验证Gq/PKC信号通路在阿哌沙班保护缺血诱导性心肌纤维化过程中的作用机制。方法:(1)①构建缺血诱导的心肌纤维化小鼠模型,不同浓度的阿哌沙班给药处理,同时设置贝那普利阳性对照组和假手术组;②H&E(Hematoxylin-eosinstaining)染色检测不同处理组小鼠心肌纤维化情况;③全自动生理记录仪记录不同处理组小鼠左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)和左心室末期舒张压(Left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP);④称取小鼠体重和心脏重量,计算不同处理组小鼠左心室重量指数(Left Ventricular Weight Index,LVWI)和右心室重量指数(Right Ventricular Weight Index,RVWI);⑤实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测心肌组织中 I 型胶原蛋白(Collagen alpha-1(I)chain,Colla1)、Ⅲ 型胶原蛋白(Collagen alpha-1(Ⅲ)chain,Colla3)和PAR-1等基因mRNA的表达;⑥Western blot检测心肌组织中Colla1、Colla3和PAR-1等蛋白的表达;⑦酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠外周血中凝血酶的活性变化;(2)①分离培养小鼠原代心肌成纤维细胞,用不同浓度凝血酶处理;②构建Gq siRNA(si-Gq)转染心肌成纤维细胞模型;③免疫荧光观察心肌成纤维细胞中Colla1和Colla3的含量;④Real-time PCR和 Western blot 检测 Colla1、Colla3 的 mRNA 和蛋白表达;⑤Western blot 检测 PKC信号通路的活化;(3)①细胞分组:Control、thrombin、thrombin+GPA2A、thrombin+GF109203X;② Western blot检测 Colla1、Coll a3、p-PKCα 和 PKCα 的蛋白表达;③小鼠分为假手术组(sham)、心肌缺血(myocardial ischemia,MI)组,阿哌沙班给药组(MI+Api)、PKC抑制剂GF109203X作用组(MI+Api+GF)和Gq蛋白拮抗剂GPA2A作用组(MI+Api+GPA);④H&E染色检测不同处理组小鼠心肌纤维化情况;⑤全自动生理记录仪记录不同处理组小鼠LVSP和左心室末期舒张压LVEDP;⑥称取小鼠体重和心脏重量,计算不同处理组小鼠LVWI和RVWI;⑦Real-time PCR和Western blot检测心、肌组织中Colla1、Colla3的mRNA和蛋白表达水平。结果:(1)与假手术组相比较,心肌纤维化小鼠的心肌纤维化程度显著升高,而阿哌沙班给药显著改善小鼠的心肌纤维化,且高浓度的阿哌沙班效果更显著,高浓度阿哌沙班与贝那普利的治疗效果没有显著差异;心肌纤维化小鼠LVSP显著降低,LVEDP显著升高,阿哌沙班治疗改善了 LVSP和LVEDP的水平,且高浓度的阿哌沙班效果更显著,高浓度阿哌沙班与贝那普利的治疗效果没有显著差异;心肌纤维化小鼠的LVWI和RVWI显著升高,阿哌沙班给药后显著降低了其心肌指数,且高浓度的阿哌沙班效果更显著,高浓度阿哌沙班与贝那普利的治疗效果没有显著差异;心肌纤维化小鼠Col1a1和Col1a3的表达显著升高,阿哌沙班给药显著降低Col1a1和Col1a3的表达,且高浓度的阿哌沙班效果更显著,高浓度阿哌沙班与贝那普利的治疗效果没有显著差异;心肌纤维化小鼠凝血酶活性显著升高,阿哌沙班给药显著降低了凝血酶活性,且高浓度的阿哌沙班效果更好,高浓度阿哌沙班与贝那普利的治疗效果没有显著差异;阿哌沙班治疗对心肌纤维化小鼠心肌组织中的PAR-1含量没有影响。(2)心肌成纤维细胞经凝血酶处理后Col1a1、Col1a3的表达显著增加;心肌成纤维细胞经凝血酶处理后PKC信号通路被活化;抑制Gq蛋白阻止凝血酶诱导的心肌成纤维细胞胶原储备;抑制Gq蛋白阻止凝血酶诱导的心肌成纤维细胞PKC信号通路的活化。(3)GPA2A或GF109203X预处理显著逆转凝血酶引起的Col1a1、Col1a3表达升高;阿哌沙班处理显著降低小鼠心肌纤维化水平,GPA2A或GF109203X处理显著抑制阿哌沙班对小鼠心肌纤维化的保护作用;阿哌沙班处理显著降低小鼠LVSP及LVEDP的水平,GPA2A或GF109203X处理显著抑制阿哌沙班对心肌LVSP和LVEDP指标的影响;阿哌沙班处理显著降低LVWI和RVWI的水平,GPA2A或GF109203X处理显著抑制阿哌沙班对LVWI和RVWI的影响。结论:(1)阿哌沙班显著缓解缺血引起的小鼠心肌纤维化。(2)凝血酶通过活化Gq/PKC信号通路促进心肌成纤维细胞中胶原储备。(3)Gq/PKC信号通路的活化参与阿哌沙班保护小鼠心肌纤维化过程。