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目前人们对鱼类肉食品的需求越来越旺盛,渔业资源却不断萎缩,为了解决这一供需矛盾,转基因鱼这一技术手段恰恰可以缓解自然界中鱼类资源的不足。然而,转基因经济鱼类的产业化却依然没有得以实施,仅仅停留在实验阶段。研究者们担心如果转基因鱼逃逸到自然界中,将会对生态环境产生极大地破坏影响,控制转基因鱼的育性是解决生态安全问题的根本,不育的三倍体鱼是解决这一问题的理想途径之一,然而仅仅依靠人工诱导制备转基因三倍体鱼效率太低,无法达到产业化的目的。异源四倍体鲫鲤是以湘江野鲤(Cyprinus cario,2n=100)为父本,以红鲫(Carassius auratas red var,2n=100)为母本,通过远缘杂交的方式获得的后代,是世界上首次获得的两性可育、遗传性状代代相传的多倍体新种群。通过异源四倍体鲫鲤(4n=200)与转基因二倍体鲤鱼(2n=100)的倍间杂交,可以大量稳定的获得不育的转基因三倍体后代,转基因三倍体鲤鱼不仅继承了普通三倍体鲤鱼不育的特性,从根本上解决了转基因鱼潜在的生态风险,而且具备比普通三倍体鲤鱼更高的生长速度。倍间杂交的方式可以大量稳定的获得转基因三倍体后代,为实现产业化奠定了良好基础。鱼类的生长、发育是一个复杂的生理过程,不同的内分泌激素在生殖轴和生长轴之间相互影响,共同作用,调控鱼类的生长发育。GH是促进鱼类生长的核心激素,GTH则主要调控鱼类性腺发育及配子成熟。两者都主要受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)为核心的神经内分泌调控,且相互之间亦有反馈影响。垂体作为HPG轴中重要的内分泌器官,在内分泌激素反馈调控中具有十分重要的意义。本研究首次系统分析了二倍体红鲫、转基因三倍体鲤鱼、普通三倍体鲤鱼、异源四倍体鲫鲤GH、GTH在不同水平的表达及反馈机制,主要内容如下:(1)采用倍间杂交的方式,以转基因二倍体黄河鲤为父本(纯合子),异源四倍体鲫鲤为母本,获得了转基因三倍体鲤鱼后代,通过特异引物PCR随机检测,实验表明子代鲤鱼中转基因的比例为100%。通过这种方式可以大批量获得转基因三倍体鲤鱼的后代,为产业化打下了基础,弥补了人工诱导的不稳定性和低效性。(2)采用反转录PCR(RT-PCR)方法,从异源四倍体鲫鲤垂体中获得FSHβ和LHβ切亚基的cDNA,连接转化到PMD18-T载体,经测序确认后,将这两个基因克隆到原核表达载体PET-32(a)中,转化到E.coli表达细菌BL21中,再次测序以确认,用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白高效表达。利用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了FSHβ和LHβ两个具备较高效价的多克隆抗体。(3)比较研究了 GH、GTH在不同倍性鲫鲤的不同组织中的表达情况。研究结果表明GH只在二倍体红鲫、普通三倍体鲤鱼、异源四倍体鲫鲤的垂体中有特异表达,令人兴奋的是我们发现在转基因三倍体鲤鱼中,GH不仅在垂体中有表达,在肌肉中亦有显著表达,可能与其快速生长特性相关联。而GTH则在不同倍性鲫鲤中均只在垂体中有特异表达。(4)在mRNA水平以及蛋白水平比较研究了 GTH不同季节在不同倍性鲫鲤中的表达情况。在繁殖季节中(五月),mRNA水平下,转基因三倍体鲤鱼垂体GTH的表达含量显著地低于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。在蛋白水平下,Western-blot的结果与mRNA水平下的结果相一致。非常有趣的是,在非繁殖季节中(11月),mRNA水平下,转基因三倍体鲤鱼垂体GTH的表达含量显著高于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤;而蛋白水平下,Western-blot结果却恰恰相反,转基因三倍体鲤鱼GTH激素的分泌依然远远低于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。这些结果表明转基因三倍体鲤鱼基因表达与激素表达紊乱,过量GH的表达对GTH的表达产生负反馈调控,从而导致转基因三倍体性腺发育异常,并最终不育。(5)在mRNA水平以及蛋白水平分别比较研究了 GH在不同倍性鲫鲤中的表达情况。mRNA水平下,垂体GH在普通三倍体鲤鱼中的表达量显著高于转基因三倍体鲤鱼、二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤,然而肌肉中GH的表达这一现象仅仅在转基因三倍体鲤鱼发生;在蛋白水平下,Western-blot的结果与mRNA水平下的结果相一致。这些结果表明外源GH基因可以对自身GH的分泌与表达产生影响,垂体中GH的表达有负反馈调控机制,这一点与其他脊椎动物相类似。GH基因在肌肉中的直接表达,是转基因三倍体鲤鱼比普通三倍体鲤鱼具备更快生长速度的原因之一。综上所述,转基因三倍体鲤鱼GH不仅在垂体具有较高表达而且在肌肉中亦发现大量表达,GH在肌肉中直接起作用这一现象可以很好的解释转基因三倍体鲤鱼具备更快的生长速度;在GH过量表达的影响下,转基因三倍体鲤鱼GTH激素在不同季节表达均比可育的二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤低,从而解释了三倍体不育的特性。本研究通过倍间杂交方式,大量获得转基因三倍体鲤鱼,为产业化奠定了基础;通过比较GH与GTH的表达,为探讨转基因三倍体鲤鱼性腺败育及快速生长的内分泌反馈机制提供了重要依据。