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目的:中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis,AAV）为一种系统性的自身免疫性疾病。其致病机制为免疫系统发生紊乱,中性粒细胞胞浆抗体（Antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA）异常增加,并诱导中性粒细胞呼吸爆发,释放毒性蛋白并黏附于血管内皮细胞,此外还能诱导中性粒细胞胞外诱捕网样结构（Neutrophil extracellular traps,NETs）异常增加,导致小血管壁炎症和纤维素样坏死。ANCA相关性血管炎天然免疫内中性粒细胞的异常特征引起的细胞胞外诱捕网形成,越来越受到研究者的重视。NETs可释放染色质纤维和抗菌细胞质蛋白,其蛋白质组成包括组蛋白、髓过氧化物酶、抗菌肽LL37、中性粒细胞弹性蛋白酶、钙网蛋白、防御素以及肌动蛋白等,NETs还可以将这些蛋白质成分传递给树突状细胞,进一步进行加工与提呈。机体的免疫反应受到活化性受体和抑制性受体的共同调节。抑制性受体,又称免疫检查点,抑制性受体是调控免疫反应、维持免疫平衡的重要调控因子。当抑制性受体功能紊乱,此时机体免疫耐受被打破,可诱导自身免疫性疾病的发生。T细胞免疫球蛋白及黏附分子3（T cell Ig and mucin domain-containing protein 3,TIM-3）是T细胞表面重要的抑制性受体分子,在自身免疫性疾病中发挥重要作用,T细胞上TIM-3的功能主要是作为抑制性受体物质抑制T细胞的功能。TIM-3除了表达于T细胞,还表达于一些固有细胞表面,单核-巨噬细胞上TIM-3参与调控单核-巨噬细胞的活化,NK细胞上TIM-3可作为NK细胞的成熟标记并与细胞的毒性相关,而针对树突状细胞（Dendritic cells,DCs）表面该分子的功能研究较少,特别是在自身免疫性疾病中。科学家已经对多种自身免疫性疾病中T细胞上TIM-3的功能进行了详细的研究,而ANCA相关性血管炎也是一种近几年发病率越来越高的自身免疫性疾病,且中国人群主要以髓过氧化物酶阳性的ANCA相关性血管炎为主。因此,本研究旨在探索髓过氧化物酶阳性的ANCA相关性血管炎中免疫细胞表面TIM-3对中性粒细胞胞外诱捕网介导的免疫反应的调控及可能作用机制的探讨。方法:选取临床上未进行药物干预的髓过氧化物酶阳性的抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）患者20例及20例健康体检者为研究对象。分离这些研究对象循环外周血单个核细胞（Peripheral blood Mononuclear cells,PBMCs）,采用流式细胞术分析外周血单个核细胞中T细胞亚群占淋巴细胞的百分比及T细胞亚群上TIM-3的表达,收集所有研究对象的临床实验室资料,并将TIM-3的表达与C反应蛋白水平及抗中性粒细胞胞浆抗体水平进行统计学相关分析。同样采用流式细胞术分析分离的外周血单个核细胞中树突状细胞上TIM-3和Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）的表达。除了分离外周血单个核细胞,同时还分离这些研究对象的外周循环中性粒细胞以及血清样本,通过间接免疫荧光技术检测中性粒细胞自发NETs形成的百分比,采用化学发光法检测血清中细胞因子（IL-6、IL-10和TNF-α）的表达,并进行相关性分析。动物实验中,分离并培养小鼠骨髓诱导树突状细胞（Bone marrow induced DCs,BMDCs）,同时分离骨髓粒细胞,使用50n M的PMA体外诱导骨髓粒细胞形成NETs,并观察NETs刺激对骨髓来源的树突状细胞的活化相关表型分子（MHCⅡ和CD86）的表达的影响,以及对细胞因子（IL-1β和IL-6）的分泌和对TLR4表达情况的影响,以及进一步采用抗TIM-3抗体处理后观察NETs刺激对骨髓诱导树突状细胞的活化及TLR4表达的变化,其中活化相关表型分子（MHCⅡ和CD86）及TLR4的变化采用流式细胞术进行测定,培养上清中细胞因子（IL-1β和IL-6）分泌水平的变化采用酶联免疫吸附方法测定。结果:与健康对照组相比,MPO-AAV患者体内CD4+T细胞亚群百分比和CD8+T细胞亚群百分比均升高,但没有统计学差异,而MPO-AAV患者体内调节性T细胞百分比呈现显著下降。MPO-AAV患者中调节性T细胞百分比与血清CRP水平呈正相关,血清中抗MPO抗体水平也与调节性T细胞在淋巴细胞中的百分比呈正相关。通过流式细胞术,我们重点还检测了MPO-AAV患者和健康对照组CD4+T细胞、CD8+T细胞以及调节性T细胞上TIM-3的表达,研究发现TIM-3在外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞以及调节性T细胞上的表达量均较低,且MPO-AAV组与健康对照组相比,CD4+T细胞上、CD8+T细胞以及调节性T细胞上TIM-3的表达均无统计学差异。TIM-3在外周血T细胞上表达较低,我们又分析了外周血循环树突状细胞上TIM-3的表达。TIM-3在外周血树突状细胞表面呈持续性高强度表达,与健康对照组相比,MPO-AAV患者中TIM-3的表达水平显著性下降,且MPO-AAV患者树突状细胞上TIM-3的平均荧光强度（Mean fluorescence intensity,MFI）与伯明翰血管炎活性评分值（Birmingham han vasculitis activity score,BVAS）及抗髓过氧化物抗体浓度水平呈负相关。同时MPO-AAV患者DCs上TLR4的表达则显著性升高。此外,MPO-AAV患者体内炎症相关细胞因子（TNF-α和IL-6）的表达水平显著性升高,体外分离的中性粒细胞自发NETs形成百分比明显增加,且细胞因子水平与自发NETs形成百分比呈显著性相关。因为NETs结构介导的中性粒细胞死亡是MPO-AAV的一个显著特征。我们试图研究诱捕网是否能促进树突状细胞成熟,首先成功诱导小鼠骨髓来源树突状细胞的形成,然后分离小鼠骨髓粒细胞,佛波酯作用下诱导中性粒细胞成功形成NETs,最后通过小鼠实验中发现,佛波酯诱导形成的NETs可有效刺激DCs活化相关表型分子（CD86和MHCⅡ）的表达及细胞因子（IL-1β和IL-6）的分泌,并增加DCs上Toll样受体4的水平。更有趣的是,使用抗TIM-3抗体阻断TIM-3信号后,可以有效增强这种现象。结论:在我们的研究中发现ANCA相关性血管炎患者中调节性T细胞百分比显著性下降,且调节性T细胞百分比与血清中抗MPO自身抗体水平呈正相关,提示调节性T细胞在调控自身反应性B细胞增殖及自身抗体分泌中可能发挥重要作用。我们研究中还发现调节性T细胞百分比还与CRP水平具有一定的相关性,提示调节性T细胞在调控炎症反应过程中发挥一定的作用,其具体机制还有待我们进一步研究。通过分析T细胞亚群上抑制性受体物质TIM-3的表达发现TIM-3在外周血T细胞上呈低水平表达,其原因可能为TIM-3在未活化T细胞上表达较低。通过分析MPO-AAV患者中性粒细胞自发NETs形成的百分比及与细胞因子的关系进一步证明了NETs参与ANCA相关性血管炎疾病的发病,NETs在疾病的炎性反应过程中发挥重要作用。而通过分析MPO-AAV患者DCs上TIM-3的表达下调及与BVAS的相关性证实DCs表面TIM-3在疾病的负调控过程中的重要作用。以及动物实验中NETs可促进DCs的活化和TLR4表达增加,以及抗TIM-3抗体处理可以增强NETs对DCs细胞因子（IL-6和IL-1β）的分泌,证明NETs可以有效触发BMDCs的成熟,且DCs表面TIM-3在NETs介导的免疫平衡过程中扮演重要角色,DCs表面TIM-3通过调控TLR4介导的固有免疫反应发挥重要的调控作用。TIM-3表达下降也可能是MPO-AAV发病机制之一,一方面,MPO-AAV中TIM-3的表达下调,使得TLR4激活的负向调控通路受到抑制,细胞因子进一步分泌,导致炎症反应的扩大;另一方面,TIM-3的表达下调,导致自身抗原的进一步被树突状细胞提呈增加,诱导更多自身抗体的产生。TIM-3和TLR4通路的交叉会话使TIM-3成为TLR4介导的免疫反应负调控的重要机制之一,但TIM-3信号通路对NETs-TLR4介导的信号通路的调控具体机制如何,以及下游通路分子,这是我们下一步研究的方向。