干扰素（interferon，IFN）是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子。自1957年Isaacs和Lindenmann首先发现干扰素（Interferon，IFN）以来，人们对IFN的研究、开发及应用从未停止过，目前IFN已被广泛应用于人医临床多种疾病的治疗。1980年WHO根据IFN抗原特异性的不同将其分为三类：IFN-α、IFN-β、IFN-γ；后来又依IFN作用的受体不同而分为两型：Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型包括IFN-α、β、w、τ、δ等；Ⅱ型只有IFN-γ,。相对而言，兽医界对动物干扰素的研究起步较晚。由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此，研究动物干扰素对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。鉴于此，本研究以猪干扰素alpha（PoIFN-α）、猪干扰素beta（PoIFN-β）与猪干扰素gamma（PoIFN-γ）为研究对象，开展了这三种细胞因子对PRV、PRRSV、FMDV抗病毒活性的研究，及其以蛋白或基因形式对猪瘟疫苗的佐剂效应的研究。主要研究内容包括：1、PoIFN-γ基因的克隆、测序分析及其原核表达以刀豆素A（ConA）诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板，采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪γ干扰素基因（PoIFNγ，501bp）。经测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与Genbank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100％；与羊、鹿、骆驼、牛、马、兔、人、鼠的氨基酸序列同源性分别78％、77％～80％、79％～80％、77％、71％、60％、59％～60％、43％。将PoIFNγ插入pGEX-KG表达载体，并转化宿主菌BL₂₁，经IPTG诱导后，得到高效表达。表达产物经SDS-PAGE分析，证明PoIFN-γ与GST融合表达，主要形成不溶性包涵体，经GelExpert软件分析确定不可溶性融合蛋白约占总蛋白的69.91％，可溶性蛋白占15.64％，大小约为43 kDa。通过对宿主菌不同时间的诱导发现目的蛋白在诱导后5小时的表达量最高，可达0.86mg／mL。将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入牛肾细胞（MDBK）上，用水泡性口炎病毒（VSV）攻毒，测出重组的PoIFNγ具有较高的抗病毒作用，生物活性达到1.0×10⁵U／mg。2、PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ的酵母分泌表达及PoIFN-β对FMDV的抑制作用为了获得高效分泌表达的重组猪α、β、γ干扰素，利用基因工程技术，分别将编码梅山猪α、β、γ干扰素成熟蛋白基因（mPoIFNα／β／γ，501／498／435 bp），亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC 9K中，构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNα／β／γ。用化学方法（LiCl）将线性化的mPoIFNα／β／γ与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115，转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后，得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选到多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1％甲醇连续诱导4天，表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明在毕赤酵母中猪α、β、γ干扰素获得分泌型表达，对表达产物进行理化分析及细胞病变抑制法(CPE₅₀)测定结果表明，表达产物具有较高的抗病毒生物活性。此外，酵母表达的PoIFN-β对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。3、猪α、β、γ干扰素在不同细胞系中的表达及其单独或联合作用对PRV增殖的抑制效果的比较分别构建3种真核表达质粒：pcDNA-PoIFNα（pcD-PoIFNα）、pcDNA-PoIFNβ（pcD-PoIFNβ）与pcDNA-PoIFNγ（pcD-PoIFNγ），分别转染HeLa、MDBK、BHK-21、PK-15及IBRS-2细胞。于转染后6、24、48、72小时检测转染细胞上清中的抗病毒活性（MDBK／VSV）。结果发现，在五种细胞中干扰素的表达量均在转染后48小时达到高峰。转染了pcD-PoIFNα的PK-15，IBRS-2和BHK-21细胞是同样转染的MDBK和HeLa细胞中表达的PoIFNα的活性的256～890倍；而转染了pcD-PoIFNβ的IBRS-2和BHK-21细胞比同样转染的PK-15和HeLa细胞中表达的PoIFNβ的活性高2.2～6倍，后两种细胞又比MDBK细胞转染后表达PoIFNβ的活性高10～14倍。对于五种转染pcD-PoIFNγ的细胞，在PK-15、IBRS-2、BHK-21和MDBK之间没有显著差异。在本研究中还比较了猪α、β、γ干扰素、及其两两联合预处理IBRS-2细胞后对PRV增殖的抑制作用。结果发现在三种干扰素中PoIFN-β能最有效的抵制PRV的增殖——100U／mL PoIFN-β就能使PRV空斑数目减少5.3倍；PoIFN-γ则能抑制PoIFN-γ达3.3倍；而PoIFN-α仅能抑制空斑数目1.26倍，且即使将其浓度上调至12800U／mL其抑制倍数也仅提高至2.3倍。当PoIFN-γ与PoIFN-α或PoIFN-β联合作用时其抑制PRV空斑数目分别达到12.8倍和100倍。而PoIFN-α或PoIFN-β与PoIFN-γ联合作用时也可有效抑制PRV复制达29和146倍。此外，实时定量PCR结果也显示了当PoIFN-γ与PoIFN-α或PoIFN-β联合刺激IBRS-2细胞时，PRV的立即早期基因mRNA比对照细胞减少23.8或133.0倍。实验结果均表明PoIFN-γ能与PoIFN-α或PoIFN-β在体外产生协同抗PRV作用。4、重组腺病毒介导的猪α、β、γ干扰素的表达及rAd-PoIFNα抗PRRSV作用分别将猪α／β／γ干扰素（PoIFNα／β／γ）基因插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建成重组质粒pSh-PoIFNα／β／γ。将此重组质粒经PmeⅠ线性化和去磷酸化后回收，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转化BJ5183感受态细胞，在Kan平板上37℃培养24h，挑选较小的菌落，提取的重组质粒经PacⅠ鉴定正确的阳性克隆命名为pAd-Sh-PoIFNα／β／γ，转化XL10-Gold^?感受态后大量制备。pAd-Sh-PoIFNα／β／γ以PacⅠ线性化后回收，用脂质体转染法转染293A包装细胞系，转染7～10天出现典型的细胞病变，说明重组了猪α／β／γ-干扰素的腺病毒基因组（缺失E1和E3基因）在其包装细胞系中成功包装成完整的病毒粒子。将此重组后的腺病毒连续接种传代，每代提取病毒基因组，PCR均能扩增出目的片段，证明该种表达猪α／β／γ-干扰素的重组腺病毒能稳定传代。利用细胞病变抑制法，收取病变后293A细胞上清，在牛肾细胞（MDBK）上进行干扰素抗病毒活性检测，结果显示猪α／β／γ干扰素的抗病毒（VSV）活性分别达83640320U／mL、5242880U／mL、1310720U／mL，说明重组腺病毒成功转导猪干扰素基因，并表达出具有良好生物学活性的猪干扰素。分别以由腺病毒介导的100U／mL，400U／mL和327680U／mL PoIFN-α预处理MARC—145细胞，同时设空白腺病毒对照。20小时后，感染不同TCID₅₀的PRRSV，逐日观察细胞病变，结果发现，高剂量的PoIFN-α能有效抑制细胞病变且呈一定的剂量相关及时间相关关系。此外，实时定量PCR结果也表明即使是低剂量的PoIFN-α也能抑制PRRSV的ORF7和Nsp9基因的表达。该实验结果预示rAd-PoIFNα能有效抑制PRRSV在体外的增殖并有望应用于临床对PRRSV的防制。5、猪α、γ干扰素增强CSFV细胞苗（c-strain）在猪体内的IgG及IgG2的抗体水平并调节Th1免疫反应分别将表达的猪α、γ干扰素蛋白（1×10⁶U、2×10⁵U、5×10⁴U／头份）或猪α、γ干扰素真核质粒（400μg／头份）与CSFV细胞苗（c-strain）联合免疫仔猪。结果发现，二免后联合免疫2×10⁵U／头份或5×10⁴U／头份重组蛋白猪α干扰素或三种剂量的猪γ干扰素与单独免疫细胞苗的对照组相比能显著提高特异性IgG的滴度。而在首免后，联合免疫10⁶U／头份猪α干扰素或任一剂量的猪γ干扰素能比细胞苗对照组或联合免疫pcD-PoIFNγ显著提高特异性IgG2的滴度。此外，它们还能将IgG2／IgG1的比率向Th1免疫方向调节，尤其是在联合免疫2×10⁵U／头份猪γ干扰素的试验组。试验结果表明，猪γ干扰素比猪α干扰素具有更强的免疫调节能力，它能有效地提高IgG、IgG1、IgG2的抗体滴度并将免疫反应调向Th1。此外，研究也表明，干扰素蛋白比真核质粒介导的干扰素更适合作为免疫调节剂；而猪γ干扰素对IgG及IgG1的调控在一定范围呈剂量负相关，猪α干扰素对IgG的调控呈剂量正相关。