研究背景及意义:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内其死亡率在男性及女性肿瘤中均位于第一位,是肿瘤相关死亡的首要原因。在美国,肺癌的发病率及死亡率近几年来呈下降趋势,但在我国,肺癌的发病率及死亡率仍在逐年上升,据国家癌症中心2017年公布的最新统计数据(2013年)显示,2013年全国新发恶性肿瘤病例数约368万例,占世界的1/4(368万/1409万),与2012年相比,癌症新发人数继续上升,癌症已经成为夺走人们健康甚至是生命的罪魁祸首之一,其中肺癌仍然位于我国癌症发病率和死亡率的第一位。目前,肺癌的病因及发病机制仍未完全明确,吸烟、空气污染、放射线暴露等都是肺癌发病的高危因素,其中吸烟(包括二手烟暴露)是肺癌的最重要的危险因素,烟草中包含的多种化学物质可以导致支气管上皮细胞中的癌基因激活、抑癌基因失活,进而引起细胞的癌变。在我国,随着工业的进一步发展,空气污染、雾霾也是导致肺癌特别是女性肺腺癌高发的因素之一,而且呈现城市多于农村、女性腺癌患者较前明显增加、年轻患者较前明显增加的趋势。约75-80%的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC),尽管近年来肺癌的治疗手段如微创手术、精准放疗、靶向治疗、免疫治疗、射频消融治疗等取得了长足的发展,但其总体5年生存率仍不高,约10-20%。导致肺癌患者预后不良的主要原因是复发和转移,约80%的肺癌患者在就诊时就已经处于局部晚期或有远处转移,术后复发及转移更是导致治疗失败或死亡的首要原因。随着对肺癌的发生、发展以及肺癌细胞侵袭和转移分子机制的深入研究,目前已经发现并证实多种肿瘤分子标志物应用于临床肺癌患者的早期检测、肿瘤进展程度及治疗效果的监测和预后的判断。而且研究发现,上皮间质转化(EMT)在肿瘤细胞侵袭及转移过程中发挥着重要的作用,是多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)转移过程中的关键特征。上皮间质转化过程涉及多种信号通路,其中包括E-钙粘蛋白的表达缺失,这也是非小细胞肺癌转移过程中的关键步骤。但是目前的各种肺癌肿瘤标志物敏感性及特异性仍不理想,因此有待研究发现更准确更实用的分子标志物,并且希望对其进行调控来发现新的肺癌治疗手段。近年来,microRNA作为一类具有重要的潜在应用价值的治疗及预后预测分子,其研究受到越来越多的重视。MicroRNA(miRNA/miR)是由19～24个核苷酸组成的高度保守的非编码短链RNA,主要通过与靶基因mRNA的3’-UTRs区域结合,使靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程,从而调控靶基因的表达。目前研究发现约1/3以上的人类基因受到miRNA的调控,一种miRNA可以调控多达200个基因,同时一种基因也可以受多种miRNA共同调控。越来越多的证据表明,在不同的肿瘤中,miRNA的作用也不同,可以起到促进或抑制肿瘤发生发展的作用。miRNA-200家族是近年来研究较为热点的领域之一,已经证实在多种肿瘤中发挥着重要的作用。miRNA-200c是miRNA-200家族的成员之一,近期有研究发现miRNA-200c在多种肿瘤中存在异常表达,且与肿瘤细胞的侵袭转移及患者的预后相关。为了进一步探索miRNA-200c在非小细胞肺癌中所起的调控作用及与肺癌预后的关系,本课题拟从以下两部分展开研究,第一部分:检测miRNA-200c在非小细胞肺癌组织中的表达情况,分析其与患者各临床病理指标之间的关系,并进行其与非小细胞肺癌患者预后的相关性研究;第二部分:预测miRNA-200c在非小细胞肺癌中的潜在靶基因,应用双荧光素报告体系进行验证,并进一步在肺癌细胞系中验证其调控作用,探索调控机制。第一部分:microRNA-200c与非小细胞肺癌预后的相关性研究目的:检测非小细胞肺癌组织中miRNA-200c的表达水平,分析miRNA-200c表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的相关性,从而探讨miRNA-200c在非小细胞肺癌中的表达与预后判定中所起的作用及其临床意义。方法:收集自2008年1月至2008年12月期间,在山东大学齐鲁医院胸外科行肺癌根治性切除+系统性淋巴结清扫术的原发性非小细胞肺癌患者组织标本110例,采用PCR基因扩增技术检测miRNA-200c的表达水平,收集所有患者的临床病理资料,包括年龄、性别、吸烟史、组织学类型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期,并对患者进行严格随访,将以上指标建立数据库。应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,应用卡方检验分析miRNA-200c与患者临床病理指标之间的关系,应用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,应用Log-rank检验比较患者的生存差别及有无统计学意义,应用Cox回归多因素分析判定独立预后因素。结果:非小细胞肺癌组织中miRNA-200c的表达水平显著上调,110例肺癌组织中,66例miRNA-200c呈高表达,44例呈低表达。miRNA-200c的高表达与肺癌淋巴结转移显著相关(P<0.05)。术后无病生存率及总生存率的单因素分析结果显示:miRNA-200c高表达患者的无病生存率及总生存率均显著低于miRNA-200c低表达患者(15.2%versus 25.0%,P=0.004;21.2%versus50.0%,P =0.000);有淋巴结转移的患者其无病生存率及总生存率显著低于无淋巴结转移的患者(9.3%versus 28.6%,P=0.000;13.0%versus 51.8%,P= 0.000);TNM分期越晚的患者其无病生存率及总生存率显著低于TNM分期早的患者(0%versus 15.6%versus 30.4%,P=0.01 1;0%versus 24.4%versus 54.3%,P= 0.002)。术后无病生存率及总生存率的多因素分析结果显示:miRNA-200c的表达水平及TNM分期分别是判定原发性非小细胞肺癌患者术后无病生存率(P=0.030,P=0.000)及总生存率(P=0.006,P=0.000)的独立危险因素。结论:1.miRNA-200c在非小细胞肺癌组织中存在高表达;miRNA-200c高表达与肺癌淋巴结转移密切相关;2.miRNA-200c高表达与非小细胞肺癌患者术后复发、转移以及不良预后密切相关,miRNA-200c可作为评估非小细胞肺癌患者预后的有效的分子标志物。第二部分:microRNA-200c在非小细胞肺癌中的潜在靶基因及其调控作用的研究目的:筛选并验证miRNA-200c在非小细胞肺癌的转移及预后中至关重要的潜在靶基因,并对其调控作用及调控机制进行进一步探索。方法:首先应用生物信息学分析数据库(TargetScan;microRNA.org;PicTar)对miRNA-200c所调控的潜在靶基因及结合位点进行预测和评分,结合文献检索,选定待研究的靶基因,合成靶基因的3’UTR调控序列并插入pcDNA3.1(+)-luciferase载体,在人胚胎肾293细胞系(HEK-293)中应用双荧光素报告体系验证选定的靶基因。然后应用RT-PCR技术进一步在非小细胞肺癌组织标本中检测靶基因mRNA的表达情况。最后应用细胞转染技术在肺癌细胞系(A549)中上调和下调miRNA-200c的表达水平,应用Western-blot法检测靶基因在蛋白水平的表达变化,应用RT-PCR检测靶基因在mRNA水平的表达变化,验证miRNA-200c在肺癌细胞系中对靶基因的调控作用,并分析调控机制。结果:通过生物信息学数据库的预测结果,结合文献检索,选取miRNA-200c的潜在靶基因ATRX、HFE和DLC1进行进一步验证和功能研究。应用双荧光素酶报告检测法成功验证靶基因。进一步检测非小细胞肺癌组织中靶基因ATRX、HFE和DLC1 mRNA的表达,结果显示ATRX、HFE和DLC1的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。在A549肺癌细胞系中上调miRNA-200c的表达,发现ATRX、HFE和DLC1的蛋白表达水平均显著下降,ATRX和HFE的mRNA表达水平显著下降,而DLC1的mRNA表达水平无明显差异;下调miRNA-200c的表达,发现ATRX、HFE和DLC1的蛋白表达水平均显著提高,ATRX和HFE的mRNA表达水平显著提高,而DLC1的mRNA表达水平无明显差异。证实了miRNA-200c在肺癌细胞系中通过不同的作用机制对靶基因起调控作用,对ATRX和HFE的调控体现在mRNA水平,对DLC1的调控体现在蛋白水平。结论:1.在非小细胞肺癌中,miRNA-200c可以调控靶基因ATRX、HFE和DLC1的表达。2.在A549肺癌细胞系中,miRNA-200c通过不同的作用机制调控靶基因的表达,根据研究结果推论,miRNA-200c通过降解ATRX和HFE的mRNA来下调其表达,通过抑制DLC1 mRNA的翻译来下调其表达。