第一部分ALDH2基因影响移植干细胞存活和治疗效应目的：利用体内试验研究ALDH2基因对组织内微环境的影响是否会进一步作用于移植而来的干细胞,并调控其生理状态及治疗效应方法：于各实验组小鼠缺血下肢肌肉中注射106个绿色荧光蛋白标记的骨髓来源间充质干细胞,其后1、2、4周分别利用小动物活体成像、组织冰冻切片的免疫荧光染色以及实时定量PCR,从动物层面、组织层面以及分子层面定量存活的骨髓间充质干细胞。在对干细胞治疗功效的检测中,利用激光多普勒血流灌注成像检测缺血肢体的血供恢复情况,利用形态学分级标准对缺血肢体的坏死情况进行分级评分,利用MASSON染色研究缺血组织的纤维化情况,并对缺血下肢的腓肠肌称重来反映其肌肉萎缩程度。结果：结果显示,不论是动物活体成像、组织学染色还是分子层面的mRNA定量检测,组织中ALDH2过表达显著上调骨髓间充质干细胞在缺血组织中的存活数量,与野生型对照组比较差异显著,而ALDH2敲除则抑制移植细胞存活,加速其在缺血组织中的死亡。与干细胞存活相对应的是各组治疗疗效的差异。在接受骨髓来源间充质干细胞治疗后,过表达组展现出最佳的治疗效果,野生型和腺病毒对照组其次,而ALDH2敲除组则最弱。结论：ALDH2基因所致的微环境差异调控干细胞的存活,并最终限制其治疗效应第一部分ALDH2基因影响移植干细胞存活和治疗效应目的：利用体内试验研究ALDH2基因对组织内微环境的影响是否会进一步作用于移植而来的干细胞,并调控其生理状态及治疗效应方法：于各实验组小鼠缺血下肢肌肉中注射106个绿色荧光蛋白标记的骨髓来源间充质干细胞,其后1、2、4周分别利用小动物活体成像、组织冰冻切片的免疫荧光染色以及实时定量PCR,从动物层面、组织层面以及分子层面定量存活的骨髓间充质干细胞。在对干细胞治疗功效的检测中,利用激光多普勒血流灌注成像检测缺血肢体的血供恢复情况,利用形态学分级标准对缺血肢体的坏死情况进行分级评分,利用MASSON染色研究缺血组织的纤维化情况,并对缺血下肢的腓肠肌称重来反映其肌肉萎缩程度。结果：结果显示,不论是动物活体成像、组织学染色还是分子层面的mRNA定量检测,组织中ALDH2过表达显著上调骨髓间充质干细胞在缺血组织中的存活数量,与野生型对照组比较差异显著,而ALDH2敲除则抑制移植细胞存活,加速其在缺血组织中的死亡。与干细胞存活相对应的是各组治疗疗效的差异。在接受骨髓来源间充质干细胞治疗后,过表达组展现出最佳的治疗效果,野生型和腺病毒对照组其次,而ALDH2敲除组则最弱。结论：ALDH2基因所致的微环境差异调控干细胞的存活,并最终限制其治疗效应第二部分ALDH2基因对缺血组织内微环境的影响,及其调控干细胞存活的作用机制目的：研究ALDH2基因通过调控组织内微环境影响于移植干细胞存活和治疗潜力的机制。方法：利用ALDH2基因敲除小鼠以及ALDH2过表达腺病毒构建ALDH2敲除及局部组织过表达模型。结扎并剪除各组小鼠单侧股动脉构建小鼠下肢缺血模型,3周后取材,行免疫荧光检测毛细血管密度,并利用蛋白芯片检测血管新生相关生长因子的表达。同时,进行氧化应激相关指标检测超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA、GSH/GSSG匕值的检测。体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,使用0、5nM、10 nM以及30 nM 4-HNE模拟ALDH2缺失所致的4-HNE堆积,分别干预细胞12h后,利用cck-8检测细胞活力并行荧光染色进行活细胞染色,Western blot检测JNK、P53蛋白表达水平。JNK信号通路抑制剂被用于研究JNK信号通路的作用。结果：ALDH2基因敲除小鼠下肢肌肉中ALDH2蛋白表达显著下调,而ALDH2过表达腺病毒转染显著提升ALDH2表达,提示ALDH2基因敲除与过表达模型构建成功。进一步研究显示,ALDH2基因敲除抑制缺血后血管新生。在微血管密度、体外血管环出芽、内皮细胞成管以及血管新生相关生长因子蛋白芯片的检测中,ADLH2敲除组均显著低于野生型小鼠。与之相反的是,ALDH2过表达则显著上调血管新生,各项指标均优于野生型小鼠。随后进行的ATP定量以及氧化应激实验显示ALDH2敲除限制微血管新生从而导致局部组织ATP含量以及抗氧化酶活性均显著低于野生型对照,与此同时代谢废物丙二醛MDA以及4HE却显著高于野生型对照组。ALDH2过表达组织则显示出较强的供养和抗氧化能力。结果显示,4-HNE处理显著抑制干细胞的活力和存活,其对细胞的毒性作用在5-30 nM范围内随浓度梯度递增。利用JNK抑制剂抑制JNK通路后,4-HNE诱导的细胞毒性有显著降低,提示4-HNE的细胞毒性可能通过JNK信号介导。Western blot实验证实,经4-HNE处理后JNK蛋白磷酸化增加,同时JNK下游P53蛋白磷酸化也有近3倍的增长。但是,JNK抑制剂可以显著降低4-HNE诱导的JNK磷酸化同时抑制下游P53蛋白磷酸化。结论：ALDH2基因调控组织缺血后血管新生、供养以及氧化应激状态,可能会导致机体微环境改变。4-HNE可能通过诱导干细胞内JNK蛋白磷酸化,从而活化其下游通路P53磷酸化,最终诱导细胞凋亡。结果：ALDH2基因敲除小鼠下肢肌肉中ALDH2蛋白表达显著下调,而ALDH2过表达腺病毒转染显著提升ALDH2表达,提示ALDH2基因敲除与过表达模型构建成功。进一步研究显示,ALDH2基因敲除抑制缺血后血管新生。在微血管密度、体外血管环出芽、内皮细胞成管以及血管新生相关生长因子蛋白芯片的检测中,ADLH2敲除组均显著低于野生型小鼠。与之相反的是,ALDH2过表达则显著上调血管新生,各项指标均优于野生型小鼠。随后进行的ATP定量以及氧化应激实验显示ALDH2敲除限制微血管新生从而导致局部组织ATP含量以及抗氧化酶活性均显著低于野生型对照,与此同时代谢废物丙二醛MDA以及4HE却显著高于野生型对照组。ALDH2过表达组织则显示出较强的供养和抗氧化能力。结果显示,4-HNE处理显著抑制干细胞的活力和存活,其对细胞的毒性作用在5-30 nM范围内随浓度梯度递增。利用JNK抑制剂抑制JNK通路后,4-HNE诱导的细胞毒性有显著降低,提示4-HNE的细胞毒性可能通过JNK信号介导。Western blot实验证实,经4-HNE处理后JNK蛋白磷酸化增加,同时JNK下游P53蛋白磷酸化也有近3倍的增长。但是,JNK抑制剂可以显著降低4-HNE诱导的JNK磷酸化同时抑制下游P53蛋白磷酸化。结论：ALDH2基因调控组织缺血后血管新生、供养以及氧化应激状态,可能会导致机体微环境改变。4-HNE可能通过诱导干细胞内JNK蛋白磷酸化,从而活化其下游通路P53磷酸化,最终诱导细胞凋亡。第三部分低氧诱导的能量储存增强骨髓间充质干细胞在缺血组织中的存活和治疗目的：利用细胞及动物试验,研究低氧处理对骨髓间充质干细胞中糖原代谢的影响,并进一步阐明该代谢适应对骨髓间充质干细胞在体内缺血组织中的存活和治疗作用的影响。方法：实验室培养绿色荧光蛋白标记的小鼠骨髓间充质干细胞,多时间点检测1%低氧处理下骨髓间充质干细胞中的糖原合成以及糖原在体外缺血模型(1%02无葡萄糖和血清培养)中的分解过程,利用CCK-8检测诱导以及消耗过程中的细胞活力的变化。设置糖原合成酶特意siRNA为糖原合成抑制组,以及对照无义siRNA对照组。将含有糖原储存和各对照干细胞注入小鼠下肢缺血模型中,2周后利用小动物活体成像和石蜡切片免疫组化检测各组干细胞在缺血组织中的存活情况。同时,利用形态学评估分级、激光多普勒血流灌注成像仪以及免疫荧光微血管染色技术来评估各组干细胞的治疗效果。结果：结果显示低氧处理显著上调干细胞中的糖原含量,在低氧处理24 h内糖原含量不断上升,而常规培养的对照组细胞中糖原含量无明显变化。其后,将两组细胞置入体外缺血模型,我们发现在实验的全过程中经低氧处理干细胞中的糖原含量均高于对照组细胞,与此相关的是这些细胞在缺血环境中的细胞活力也显著高于对照组。在体内研究中,活体成像结果显示糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,抑制糖原合成可以显著地降低低氧处理带来的效果改善。动物体内结果在组织学层面的石蜡切片免疫组化染色亦得以证实。各组干细胞在缺血组织中的存活差异,进一步导致其最终治疗效果的不同。我们的结果显示,糖原储存提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果。结论：糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果微血管染色技术来评估各组干细胞的治疗效果。结果：结果显示低氧处理显著上调干细胞中的糖原含量,在低氧处理24 h内糖原含量不断上升,而常规培养的对照组细胞中糖原含量无明显变化。其后,将两组细胞置入体外缺血模型,我们发现在实验的全过程中经低氧处理干细胞中的糖原含量均高于对照组细胞,与此相关的是这些细胞在缺血环境中的细胞活力也显著高于对照组。在体内研究中,活体成像结果显示糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,抑制糖原合成可以显著地降低低氧处理带来的效果改善。动物体内结果在组织学层面的石蜡切片免疫组化染色亦得以证实。各组干细胞在缺血组织中的存活差异,进一步导致其最终治疗效果的不同。我们的结果显示,糖原储存提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果。结论：糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果第四部分低氧诱导增强骨髓间充质干细胞代谢适应的作用机制目的：研究低氧处理诱导骨髓间充质干细胞糖原代谢的调控机制。方法：体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,使用Akt抑制剂LY294002、HIF-1 siRNA以及GSK-3β过表达腺病毒,通过抑制和过表达特定基因研究其对糖原代谢的作用。同时,利用糖原染色、糖原定量、免疫荧光染色、Real-Time PCR以及Western Blot技术,检测糖原合成相关基因的表达情况,利用酶学检测检验糖分解酶的酶活性,从而从糖原的合成和分解两方面进一步阐明AktHIF-1GSK-3β信号通路在低氧调控糖原代谢中的作用机制。结果：结果显示,抑制Akt信号通路处理显著抑制干细胞中低氧诱导的糖原合成,其机制在于：(1)分解糖原的糖原磷酸化酶活性提升；(2)HIF-1信号通路被抑制,进而下调HIF-1依赖的一系列糖原合成相关基因的表达下调(包括Glut 1、 HK、PGM1、GS1); (3)提升GSK-3β酶活性,从而促进糖原解聚分解。在体外缺血模型中进行的糖原分解实验显示：经低氧处理的干细胞,其胞内糖酵解关键酶的酶活性显著高于对照组,提示低氧处理不仅上调细胞内糖原合成量同时促进糖原在恶性条件下的快速降解利用。结论：,Akt信号通路通过直接(调控糖原磷酸化酶)和间接(通过HIF-1/GSK-3 β级联通路)的方式调控干细胞中的糖原代谢,参与干细胞代谢适应,进而促进干细胞在缺血环境中的存活和治疗。微血管染色技术来评估各组干细胞的治疗效果。结果：结果显示低氧处理显著上调干细胞中的糖原含量,在低氧处理24 h内糖原含量不断上升,而常规培养的对照组细胞中糖原含量无明显变化。其后,将两组细胞置入体外缺血模型,我们发现在实验的全过程中经低氧处理干细胞中的糖原含量均高于对照组细胞,与此相关的是这些细胞在缺血环境中的细胞活力也显著高于对照组。在体内研究中,活体成像结果显示糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,抑制糖原合成可以显著地降低低氧处理带来的效果改善。动物体内结果在组织学层面的石蜡切片免疫组化染色亦得以证实。各组干细胞在缺血组织中的存活差异,进一步导致其最终治疗效果的不同。我们的结果显示,糖原储存提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果。结论：糖原储存可以显著地提升干细胞在缺血组织中的存活,提升干细胞对缺血坏死、肢体血流灌注以及微血管密度方面的治疗效果第四部分低氧诱导增强骨髓间充质干细胞代谢适应的作用机制目的：研究低氧处理诱导骨髓间充质干细胞糖原代谢的调控机制。方法：体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,使用Akt抑制剂LY294002、HIF-1 siRNA以及GSK-3β过表达腺病毒,通过抑制和过表达特定基因研究其对糖原代谢的作用。同时,利用糖原染色、糖原定量、免疫荧光染色、Real-Time PCR以及Western Blot技术,检测糖原合成相关基因的表达情况,利用酶学检测检验糖分解酶的酶活性,从而从糖原的合成和分解两方面进一步阐明AktHIF-1GSK-3β信号通路在低氧调控糖原代谢中的作用机制。结果：结果显示,抑制Akt信号通路处理显著抑制干细胞中低氧诱导的糖原合成,其机制在于：(1)分解糖原的糖原磷酸化酶活性提升；(2)HIF-1信号通路被抑制,进而下调HIF-1依赖的一系列糖原合成相关基因的表达下调(包括Glut 1、 HK、PGM1、GS1); (3)提升GSK-3β酶活性,从而促进糖原解聚分解。在体外缺血模型中进行的糖原分解实验显示：经低氧处理的干细胞,其胞内糖酵解关键酶的酶活性显著高于对照组,提示低氧处理不仅上调细胞内糖原合成量同时促进糖原在恶性条件下的快速降解利用。结论：,Akt信号通路通过直接(调控糖原磷酸化酶)和间接(通过HIF-1/GSK-3 β级联通路)的方式调控干细胞中的糖原代谢,参与干细胞代谢适应,进而促进干细胞在缺血环境中的存活和治疗。第四部分低氧诱导增强骨髓间充质干细胞代谢适应的作用机制目的：研究低氧处理诱导骨髓间充质干细胞糖原代谢的调控机制。方法：体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,使用Akt抑制剂LY294002、HIF-1 siRNA以及GSK-3β过表达腺病毒,通过抑制和过表达特定基因研究其对糖原代谢的作用。同时,利用糖原染色、糖原定量、免疫荧光染色、Real-Time PCR以及Western Blot技术,检测糖原合成相关基因的表达情况,利用酶学检测检验糖分解酶的酶活性,从而从糖原的合成和分解两方面进一步阐明AktHIF-1GSK-3β信号通路在低氧调控糖原代谢中的作用机制。结果：结果显示,抑制Akt信号通路处理显著抑制干细胞中低氧诱导的糖原合成,其机制在于：(1)分解糖原的糖原磷酸化酶活性提升；(2)HIF-1信号通路被抑制,进而下调HIF-1依赖的一系列糖原合成相关基因的表达下调(包括Glut 1、 HK、PGM1、GS1); (3)提升GSK-3β酶活性,从而促进糖原解聚分解。在体外缺血模型中进行的糖原分解实验显示：经低氧处理的干细胞,其胞内糖酵解关键酶的酶活性显著高于对照组,提示低氧处理不仅上调细胞内糖原合成量同时促进糖原在恶性条件下的快速降解利用。结论：,Akt信号通路通过直接(调控糖原磷酸化酶)和间接(通过HIF-1/GSK-3 β级联通路)的方式调控干细胞中的糖原代谢,参与干细胞代谢适应,进而促进干细晌在缺血环境中的存活和治疗。