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第一部分蛋白酶体亚基PSMD2在乳腺癌中的表达情况目的:分析泛素蛋白酶体系统相关基因在乳腺癌中的差异表达谱,筛选出具有显著表达差异的目标基因进行验证,并分析其与乳腺癌临床病理特征相关性及预后价值。方法:利用TCGA数据库,分析泛素蛋白酶体系统797个相关基因在乳腺癌中的表达差异。筛选出具有显著表达差异的基因PSMD2进行RT-qPCR和IHC验证。利用卡方检验分析PSMD2的表达与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系。利用生存曲线和Cox比例风险模型分析PSMD2与乳腺癌预后的相关性。结果:差异基因分析发现,相比于正常组织,在乳腺癌组织中有208个基因表达显著上调,239个基因表达下调。在所有异常表达的26S蛋白酶体核心成分中,PSMD2在癌组织中的表达水平最高。利用RT-qPCR,在32对乳腺癌和正常组织中证实PSMD2的mRNA水平在乳腺癌组织中的表达显著高于正常组织。利用IHC证实,PSMD2的蛋白表达水平在癌组织中的表达同样要明显高于正常组织。高表达PSMD2与患者年龄(p=0.031)、肿瘤大小(p=0.006)、腋窝淋巴结转移(p=0.023)和TNM分期(p=0.016)密切相关。PSMD2高表达的患者总体生存期OS和无远处转移生存期DMFS更差,但PSMD2与无复发生存期RFS无明显相关性。多因素COX回归分析发现,PSMD2可作为OS(HR=3.15,95%CI:1.08-9.23,p=0.036)和DMFS(HR=3.16,95%CI:1.29-7.72,p=0.012)的独立预后因素。结论:相比于正常组织,PSMD2在乳腺癌组织中的表达显著上调。PSMD2的表达与乳腺癌的预后密切相关,并可作为乳腺癌的独立预后因素。第二部分PSMD2对乳腺癌细胞功能的影响及初步机制探讨目的:研究PSMD2在乳腺癌中的生物学功能,并初步探讨PSMD2发挥生物学功能的相关机制。方法:利用GSEA基因富集分析,预测PSMD2在乳腺癌中的潜在的生物学功能。通过siRNA干扰技术,利用CCK-8、克隆形成、裸鼠成瘤等实验手段,检测PSMD2对乳腺癌细胞增殖、肿瘤生长的影响;利用流式细胞术检测PSMD2对乳腺癌细胞周期和凋亡的影响。应用western blot检测在干扰PSMD2条件下,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、cyclin D1、E2F1、Rb、p Rb、p21、p27和凋亡相关蛋白caspase-7、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9的变化。利用免疫荧光检测干扰PSMD2条件下p21和p27定位改变。在干扰PSMD2的同时,敲低p21和/或p27,通过流式分析p21和p27在PSMD2细胞周期调控中的作用。结果:GSEA分析发现,PSMD2与细胞增殖、细胞周期和凋亡密切相关。细胞功能试验证实干扰PSMD2后,乳腺癌细胞在增殖水平受到了明显的抑制。裸鼠成瘤实验发现,敲低PSMD2可显著抑制肿瘤生长。此外,干扰PSMD2可导致乳腺癌细胞G0/G1期的比例显著增加,S期的细胞比例显著减少。Western blot结果显示,敲低PSMD2之后,CDK4、CDK6、cyclin D1、E2F1和p Rb均出现显著下调,而p21和p27的表达则显著升高。干扰PSMD2还可促进乳腺癌细胞的凋亡,并伴随凋亡相关蛋白cleaved caspase-7和cleaved caspase-9的上调。免疫荧光和胞核胞浆蛋白分离实验发现上调的p21和p27主要位于细胞核内。干扰p21和/或p27,可明显逆转PSMD2敲低引起的细胞周期阻滞。结论:干扰PSMD2可抑制乳腺癌细胞增殖、促进凋亡、抑制肿瘤生长,并导致乳腺癌细胞G0/G1期阻滞。在一定程度上,PSMD2是通过p21和/或p27影响的乳腺癌细胞周期进程。第三部分PSMD2调控p21和p27表达的分子机制研究目的:深入研究PSMD2调控p21和p27表达的分子机理,阐明PSMD2影响乳腺癌细胞周期进程的具体机制。方法:利用蛋白酶体活性检测试剂盒检测PSMD2敲低对蛋白酶体活性的影响。Western blot分析PSMD2敲低后p21和p27半衰期的改变。应用免疫沉淀实验分析PSMD2对泛素化形式的p21和p27表达水平的影响。利用乳腺癌病例石蜡样本连续切片,研究PSMD2与p21和p27在组织中蛋白表的相关性。免疫共沉淀实验检测PSMD2与p21和p27的蛋白质结合。免疫荧光分析PSMD2与p21和p27在乳腺癌细胞中的共定位。应用免疫共沉淀和GST pull-down实验,验证USP14与PSMD2结合情况。siRNA干扰USP14之后,western blot检测p21和p27表达以及泛素化水平的变化。结果:PSMD2与p21和p27在m RNA水平无明显相关性。敲低PSMD2,可导致蛋白酶体的活性明显下降,总的泛素化蛋白水平上调。敲低PSMD2可显著延长p21和p27的半衰期,并且p21和p27的泛素化水平也出现了明显的升高。50例乳腺癌病例石蜡样本连续切片免疫组化结果显示,PSMD2与p21和p27在蛋白表达水平呈显著负相关性。共转染和免疫共沉淀实验证实PSMD2可与p21和p27结合。共定位分析发现PSMD2与p21和p27主要共定位于细胞核。免疫共沉淀和GST pull-down实验证实USP14可与PSMD2结合。敲低USP14后p21和p27的蛋白水平明显升高,但对PSMD2并无影响。免疫沉淀实验发现,p21和p27的泛素化水平也出现明显升高。结论:PSMD2可与p21和p27结合。USP14很可能参与了PSMD2介导的p21和p27降解。