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基于当前猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外生产所存在的效率低下这一突出问题,本研究就丰富和优化猪卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)培养及核移植胚胎的最佳培养条件,以其稳定的获取早期囊胚,及搭建猪体细胞核移植技术基础平台,为最终生产克隆猪提供依据,开展了如下研究:首先,我们比较了不同的基础培养基,以及基础培养基中添加Ghrelin和胰岛素对猪卵母细胞IVM与成熟后孤雌发育的影响,尝试将Ghrelin添加到猪卵母细胞体外成熟液中,据我们查阅文献所知,这在国内外尚属首次。我们还比较了50nM曲古抑菌素(TSA)处理0h、12h、24h、36h、48h对猪体细胞克隆胚胎发育的影响。最后,我们比较了胚胎培养基中添加胰岛素对猪孤雌激活胚胎发育的影响。具体研究结果如下:(1)以TCM199、DMEM和NCSU23为基础培养基,添加相同成分配制成猪卵母细胞IVM培养液,发现以NCSU-23为基础培养基时,卵母细胞核成熟率最高,且明显优于DMEM组(69.54±2.74%vs.52.82±5.72%,P＜0.05),成熟后激活胚胎发育NCSU-23组明显优于TCM-19和DMEM组(卵裂率74.25±8.39%vs.60.25±1.42%vs.43.75±1.55%,P＜0.01)。(2)以不同浓度Ghrelin(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)添加到相同猪卵母细胞IVM培养液,发现添加Ghrelin各组卵母细胞成熟率略低于对照组,但各组间差异不显著(53.42±6.04%vs.51.37±5.37%vs.47.94±3.23%vs.47.71±3.18%vs.49.15±3.47%,P＞0.05);成熟后激活胚胎发育率Ghrelin添加组高于对照组,50ng/ml组卵裂率最高,但各组差异不显著;100ng/ml组囊胚率最高,但各组间差异也不显著。(3)以不同浓度胰岛素(0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)添加到相同猪卵母细胞IVM培养液,发现添加胰岛素各组卵母细胞成熟率高于对照组,5μ/mlg组成熟率最高,对照组最低,且5μg/ml与各组差异极显著(81.84±2.54%vs.61.96±1.82%vs.67.32±2.06%vs.70.53±2.31%vs.70.07±1.84%,P＜0.01);2.5μg/ml组与对照组差异显著(70.53±2.31%vs.61.96±1.82%P＜0.05);在后期胚胎发育中,5μg/ml卵裂率最高,且与对照组差异显著(60.76±2.19%vs.48.84±2.44%P＜0.05),其他各组差异不显著;同样5μg/ml囊胚率最高,且与对照组差异极显著(49.23±6.38%vs.30.11±1.37%vs.40.43±3.02%vs.39.52±5.02%vs.40.98±1.93%,P＜0.01),其他各组差异不显著。(4)在胚胎培养液PZM3中添加50nM TSA,处理不同时间(0h、12h、24h、36h、48h),发现各组卵裂率之间差异不显著;TSA处理组囊胚率高于对照组,36hTSA处理组与对照组差异极显著(37.39±1.78%vs.19.17±3.15%,P＜0.01)与12h TSA处理组差异显著(37.39±1.78%vs 23.98±4.84%,P＜0.05),24h、48hTSA处理组与对照组差异显著(35.11±4.47%vs.19.17±3.15%,33.49±1.13%vs.19.17±3.15%,P＜0.05),其中36h TSA处理组囊胚率最高。(5)在PZM3中添加不同浓度胰岛素(0μml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)发现添加胰岛素各组胚胎发育情况优于对照组,2.5μg/ml组卵裂率最高,5μg/ml组其次,且这两组与对照组差异极显著(66.10±2.22%vs.64.78±2.82%vs.49.48±4.91%,P＜0.01),10μg/ml组与对照组差异显著(55.44±3.00%vs.49.48±4.91%,P＜0.05);试验组囊胚率也高于对照组,其中5μg/ml组与对照组差异极显著(34.42±3.42%vs.27.75±1.44%,P＜0.01)。上述结果表明:①NCSU-23作为猪卵母细胞成熟培养液效果最好,且促进成熟后激活胚胎发育至囊胚期,获得较高的卵裂率和囊胚率。②添加Ghrelin对卵母细胞成熟不利,同时也没有显著提高后期胚胎发育的能力。③在成熟液中添加5μg/ml胰岛素能显著提高卵母细胞成熟率及后期胚胎发育的卵裂率、囊胚率。④重构胚胎经24h-36 hTSA处理能够促进重构胚胎发育至囊胚期,获得较高的囊胚发育率。⑤在胚胎培养液中添加胰岛素对胚胎发育有促进作用,添加2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml能显著提高卵裂率,添加5μg/ml能显著提高囊胚率。综上所述,本研究初步搭建了猪体细胞核移植技术基础平台,以NCSU-23为猪卵母细胞成熟液基础液,在成熟液中添加5μg/ml胰岛素,在胚胎培养液中添加2.5μg/ml胰岛素,并将重构胚用50nM TSA处理36h,猪克隆胚胎体外培养可发育至囊胚期。