椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)是脊柱退变性病变的病理学基础,虽然当前有很多研究均报道了IDD的发病机制,但仍未阐明其详细的病理机制。研究表明诱发IDD的因素错综复杂,其中细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的变化为IDD病理变化其中一个代表性病变,相关的研究指出,在IDD发生发展时,其中髓核组织内含有的Ⅱ型胶原水平渐渐降低,Ⅰ型胶原随之上升,且这两种物质改变的程度和IDD发展的情况呈正相关。整合素(integrin,ITG)源自于胶原受体,其存在于髓核细胞内,整合素通过其含有的Ⅰ/Ⅱ型胶原与二个亚基(α2β1与α1β1)联接在一起,介导细胞内、细胞外的信息交流,进一步起到生物学功能。本研究通过深入的比较在健康椎间盘和退变性椎间盘组织内miR-198、ITGA1、COL1A1 mRNA、编码蛋白的分布及水平,分析miR-198是否能够有效的调控机体及髓核细胞ECM内含有的整合素、Ⅰ型胶原,再利用表观遗传学机制研究miR-198的上游调控作用。若能将以上问题阐明将有助于相关领域进一步了解IDD疾病的发生发展过程中ECM变化的确切机制,且有助于为miR-198基因可能成为临床上治疗IDD病变的作用靶点给予科学的依据。该研究共由下列4个实验组成:实验一 人体髓核组织中miR-198及COL1A1、ITGA1表达量的研究目的:通过前期的microRNA芯片检测miR-198基因在疾病IDD内的表达水平?本研究通过分析miR-198、ITGA1及COL1A1 mRNA及其对应的蛋白在健康及IDD髓核组织中的差异性表达。方法:分别获取5例IDD病人髓核标本、5例健康椎间盘死亡患者标本,通过实时定量PCR技术测定两组表达的miR-198基因、ITGA1及COL1A1 mRNA水平,通过天狼猩红染色技术了解两组的胶原分布情况,经HE染色法了解两组的病理学改变,通过免疫荧光染色技术、Westen blot技术了解两组表达的整合素α1、Ⅰ型胶原水平,通过荧光双标技术了解两组共表达的miR-198基因COL1A1、ITGA1的水平。结果:根据天狼猩红染色显示IDD中Ⅰ型胶原逐渐开始代替Ⅱ型胶原,miR-198水平降低,ITGA1及COL1A1 mRNA及其对应的蛋白表达水平提升,荧光结果指出miR-198基因中呈阳性细胞的COL1A1、ITGA1的表达呈阴性,反之则反。结论:髓核组织表达的miR-198基因、ITGA1及COL1A1 mRNA及其对应的蛋白miR-198水平表现为负向调控作用。实验二 miR-198对COL1A1及ITGA1表达调控的体外研究目的:实验一在IDD病变组织中观察到miR-198基因表达水平明显下调,COL1A1、ITGA1两类mRNA、相应蛋白表达增多。但是仍然存在下列疑问,以上结果是因为miR-198基因对COL1A1、ITGA1 mRNA发挥的诱导作用产生的,还是因为其他中间环节引起的?采用生物信息学技术提示,存在COL1A1 mRNA、ITGA1里的3’UTR能与miR-198靶基因在一块结合的可能性?因此,实验二主要采用体外病毒转染调控、双荧光素酶报告基因等技术研究miR-198直接调控ITGA1、COL1A1 mRNA基因的情况,并分析其是否会影响细胞的功能学特征。方法:选择双荧光素酶报告基因技术对miR-198与COL1A1、ITGA1 mRNA 3’UTR间的关系进行测定,进而观察髓核细胞中miR-198的水平改变,选择western blot测定ITGA1、COL1A1的表达水平;选择实时定量PCR技术验证骨肉瘤细胞系U-2OS、MG-63内表达了miR-198基因后,经慢病毒对U-2OS、MG-63进行转染,观察细胞中miR-198的水平改变,选择细胞划痕、Trans-well试验测定其是否会影响细胞的功能学特征。结果:miR-198能够与COL1A1、ITGA1 mRNA 3’UTR发生直接作用,将miR-198基因水平下调或上调后可进一步调控髓核细胞内表达的ITGA1、COL1A1水平。结果显示相比于miR-198下调组,miR-198上调组内MG-63、U-2OS表现出的愈合速度更快。此外,miR-198上调组内MG-63、U-2OS表现出增强的迁移率、侵袭率;miR-198水平下调组MG-63、U-2OS表现出下降的迁移率、侵袭率。结论:miR-198基因通过与COL1A1、ITGA1 mRNA 3’UTR发生直接作用,可对Integrinα1、CollagenⅠ蛋白的表达水平进行调控,最终影响细胞的功能学特征?实验三 miR-198对COL1A1及ITGA1表达调控的体内研究目的:通过实验一、二我们知道miR-198基因能够直接作用于COL1A1、ITGA1mRNA 3’UTR两个靶基因,并经体外研究验证了以上现象。但因为体外培养细胞的结构通常较简单,能够较好的控制培养条件,不存在较多的影响因素,因此,无法比拟活体的椎间盘组织生长环境。实验三采用C57动物IDD模型对miR-198基因水平进行转染,深入的了解及探讨miR-198基因是否会影响IDD疾病的进程。方法:选择实时定量PCR技术测定C57小鼠表达的miR-198水平,经鼠尾穿刺法构建IDD模型,使其转染腺相关病毒后,下调或者上调椎间盘内表达的miR-198水平,经western blot法测定转染后第3、第6、第12w个节点表达的Integrinα1、CollagenⅠ水平,结合椎间隙高度指数、双标法、组织学评分方法来了解不同节点小鼠IDD情况的差异性。结果:成功建模后的第3周、第6周、第12周随着时间的延长表达的Integrinα1、CollagenⅠ蛋白水平增加,下调或上调/miR-198基因能够提升或下降不同时间节点表达的Integrinα1、CollagenⅠ水平;相比于对照组和miR-198下调组,miR-198上调各个节点有着更高的组织学评分、椎间隙高度指数。结论:在体内实验中miR-198基因能够有效的保护IDD,miR-198下调能加剧IDD疾病的演变。实验四 miR-198表观遗传学调控机制的研究目的:经过实验一、实验二证实了在IDD髓核组织内miR-198基因对其潜在位点的调控机理,实验三通过在体验证的方式给予了证实。但尚未阐明其详细的作用机制,实验四将深入的研究miR-198基因的调控机理。方法:各取5例IDD组织、正常对照组,通过甲基化DNA Me DIP-PCR技术测定miR-198两个前体启动子相邻区域的4个Cp G岛,经5Aza-Cd R对体外环境下培养的原代髓核细胞进行处理,行q RT-PCR测定了解其调控miR-198、COL1A1、ITGA1mRNA情况。结果:IDD组miR-198两个前体启动子10kb之内4个可能的甲基化位点更容易发生甲基化现象,但结果具有统计学差异性(P<0.05)的仅以下2个位点:chr11:43596990-43597336、chr11:43602545-43603215,经5Aza-Cd R作用后髓核细胞表达的miR-198水平上升,COL1A1、ITGA1mRNA水平下降。结论:在IDD中miR-198表达水平异常与chr11:43596990-43597336、chr11:43602545-43603215这2个Cp G岛出现的甲基化程度异常具有密切的联系。