中药饮片在中医临床中发挥的核心作用正日益显现,但指导其合理应用的中药炮制理论尚缺乏现代科学论据,已成为制约中药现代化的瓶颈。五味子醋制治疗肝病取得显著临床疗效,但其保肝作用机制未见研究。药物保肝作用机制与代谢酶及信号通路等有关。基于上述问题及课题前期研究基础,课题将Realtime-PCR、Western blot、免疫组化等前沿技术引入炮制理论研究领域。以Nrf2/ARE通路为切入点,评价信号通路与机体之间关联性。从整体和分子水平,研究阐明了五味子醋制是通过调控Nrf2/ARE通路而发挥保肝作用。课题研究的主要内容如下:1.五味子的炮制及质量评价 采用符合2010年版《中国药典》要求的五味子为原料,进行生、醋五味子样品的制备,以“一测多评”法检测五味子醋制前后五味子醇甲等8种木脂素类成分含量变化。结果显示:五味子醋制前后木脂素单体成分的含量及比例产生不同的影响。其中,五味子醋制以后除五味子酯甲含量升高以外,其他7个木脂素成分均有所降低,生品中五味子醇甲:戈米辛J:五味子醇乙:戈米辛G:五味子甲素:味子酯甲:五味子乙素:五味子丙素为22.11:2.06:7.60:1.00:0.50:4.95:14.60:2.45;醋制后变为 23.61:1.74:5.42:1.00:1.14:6.57:11.89:1.29。这种变化结果不仅为五味子醋制前后特异性的质量评价方法提供了可靠的依据,而且很可能是五味子醋制后保肝作用增强的重要原因之一,为传统的醋制理论提供了有效的科学依据2.生、醋五味子对大鼠急性肝损伤的效应及机制研究 课题组前期实验研究对大鼠急性酒精性肝损伤进行了效应评价,检测血清ALT、AST、SOD、ADH、TBIL、CHO、TG、HDL、LDL以及肝组织SOD、MDA、ADH活性。结果表明,五味子醋制对急性酒精性肝损伤有一定的增强治疗和预防作用。在此基础上,采用Western blot、免疫组化法和Real-time PCR法检测肝组织CYP2E1、Nrf2、HO-1、GCLM、NQO1的蛋白和基因表达水平。结果表明,各给药组均明显下调了因酒精性肝损伤导致的CYP2E1蛋白及mRNA基因水平上升,诱导了 Nrf2核蛋白及 HO-1、GCLM、NQO1 总蛋白和 Nrf2、HO-1、GCLM、NQO1 的 mRNA 表达水平上升（P<0.01）;五味子醋制以后,作用增强,与生五味子低剂量组相比,醋五味子低剂量组对CYP2E1蛋白及mRNA表达的下调作用明显增强（P<0.05）,GCLM、NQO1 蛋白表达显著上升（P<0.05）,HO-1、GCLM、NQO1 的 mRNA表达均显著增强（P<0.05）;与生五味子高剂量组相比,醋五味子高剂量组GCLM)蛋白及mRNA和NQO1的mRNA表达显著上升（P<0.05）;醋五味子高剂量组与阳性组无显著性差异。提示了五味子醋制后抗急性肝损伤作用增强的机制很可能是通过对CYP2E1活性和Nrf2/ARE信号通路的调控,来实现其降低肝脏急性炎症、脂肪堆积等病变程度的保肝作用。3.生、醋五味子对大鼠慢性肝损伤的效应及机制研究 实验以SD大鼠为对象,采用慢性酒精肝损伤模型,病理切片显示慢性酒精性肝损伤模型复制成功后,采用紫外分光光度计和酶标仪检测血清和肝组织的相关生化指标,系统评价生、醋五味子高、低剂量组以及阳性药物的保肝效应。实验结果显示,生、醋五味子均能改善因酒精引起的体重增长缓慢、肝肾指数的上升、肝肿胀变性、炎性浸润、脂肪堆积等情况;能够使血清和肝组织AST、ALT、AKP、TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-β、IL-6、ROS、MDA以及血清GGT、LDH的水平的显著降低,血清和肝组织HDL-C、GSH-Px、ADH、SOD、CAT和GSH的水平显著升高,系统评价说明五味子对慢性酒精性肝损伤有治疗与预防的功能,醋五味子组明显高于生五味子组（P<0.05）。在此基础上,采用Western blot、免疫组化法和Real-time PCR 法检测 CYP2E1、Nrf2、HO-1、GCLM、NQO1 的蛋 白和基 因表达水平。结果表明,各给药组均明显下调了 CYP2E1蛋白及mRNA基因水平上升,Nrf2表达及Nrf2蛋白核转移显著增多,并显著调控了下游靶基因及蛋白HO-1、GCLM、NQO1的表达（P<0.05）;五味子醋制后对抑制CYP2E1蛋白(和mRNA表达水平升高的能力显著提高（P<0.05）,且对Nrf2核蛋白及mRNA和HO-1、GCLM、NQO1蛋白及mRNA上调作用显著增强（P<0.01）;醋五味子高剂量组略逊于阳性组。提示了五味子醋制后抗慢性肝损伤作用增强的机制很可能是通过调控CYP2E1活性和Nrf2/ARE信号通路,来实现其降低肝脏慢性炎症、脂肪堆积等病变程度的保肝作用。综上所述,课题选择生、醋五味子为研究对象,对其炮制前后具有代表性的木脂素类成分含量及比例变化进行了研究,对大鼠酒精性肝损伤的效应及其信号通路进行了比较。研究结果显示五味子醋制前后木脂素单体成分的含量及比例产生不同的影响,且五味子是通过降低炎症因子、减少脂肪堆积、降低CYP2E1表达以及增强Nrf2/ARE信号通路调控等来对抗因酒精代谢物等导致的肝损伤,有一定的剂量依赖性且醋制后保肝作用增强,研究初步阐明了五味子醋制是“通过调控CYP2E1活性和Nrf2/ARE通路而发挥保肝作用”,为醋五味子的临床更为科学合理应用提供理论依据,也为传统中药醋制理论的现代化研究提供了新的思路。