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中暑(heat stroke)由于全身炎症反应(SIRS)作用,广泛存在着血管内皮(VEC)损伤,伴随血管渗漏、出血、组织水肿等病理改变,导致微循环障碍、休克与多器官功能障碍综合征(MODS)。血管通透性的改变与血管内皮的粘附连接(AJ)及血管内皮钙粘素(VE-Cadherin)的功能结构紧密相关。然而,中暑的血管通透性变化规律及其深入分子信号通路机制的研究仍有待开展。目的:1.研究热打击下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的通透性变化规律。2.研究p38 MAPK通路对热打击所致HUVECs通透性变化及对VE-Cadherin分布变化的影响。方法:1.热打击引起内皮细胞通透性变化及其分子机制1.1.构建体外HUVECs热打击模型,根据不同热打击温度分为对照组、39℃组、41℃组和43℃组,利用Transwell技术检测单层内皮细胞跨膜电阻值(TEER),利用荧光蛋白跨膜渗漏实验计算细胞通透系数(Pa)。TEER越低、Pa越大,细胞通透性越高;1.2.根据不同热打击时间把HUVECs分为对照组、1h组、2h组、和3h组,检测TEER,计算Pa,研究不同热打击时间对细胞通透性的影响。1.3.根据不同热打击时间把HUVECs分为对照组、0.5h组、1h组、1.5h组和2h组,利用Western Blot方法检测同一热打击温度下(43℃)HUVECs中VE-Cadherin总蛋白、膜蛋白和浆蛋白的含量与分布。2.p38 MAPK通路在热打击引起内皮细胞透通性变化中的作用2.1.构建HUVECs热打击模型,根据不同热打击时间分为对照组、0.5h组、1h组、1.5h组和2h组,Western Blot方法检测HUVECs中p38蛋白的磷酸化水平;2.2.构建HUVECs热打击模型,根据不同的处理因素分为对照组、SB组(p38抑制剂SB203580,浓度10uM)、HS组(热打击组)和SB+HS组。其中,SB组是预先在HUVECs加入SB203580并于细胞培养箱中共孵育2h,SB+HS组是在HUVECs加SB203580共孵育2h后行43℃热打击2h。检测各组TEER,计算Pa,以此表示HUVECs通透性;2.3.根据不同处理因素把HUVECs分为对照组、SB组、HS组和SB+HS组。分组处理后,通过Western blot及免疫荧光的方法检测VE-Cadherin在胞膜、胞浆中的含量及分布情况。结果:1.热打击引起内皮细胞透通性变化及其分子机制1.1.不同热打击温度下HUVECs的通透性改变:热打击下HUVECs的TEER显著降低、Pa显著增大,细胞通透性增高。随热打击温度升高,TEER逐渐降低、Pa逐渐增大;1.2.不同热打击时间下HUVECs的通透性改变:随热打击时间延长,TEER逐渐显著降低、Pa逐渐显著增大,细胞通透性增高。1.3.热打击下 HUVECs 的 VE-Cadherin 改变:1.3.1.在热打击过程中,HUVECs中VE-Cadherin蛋白总量随热打击时间延长变化无统计学意义;1.3.2.在热打过程中,HUVECs中VE-Cadherin在胞膜上含量显著减少,在胞浆中含量显著增加。2.p38 MAPK通路在热打击引起内皮细胞透通性变化中的作用2.1.早期热打击即可使HUVECs的p38磷酸化水平显著增高;2.2.p38 MAPK通路抑制剂SB203580预处理,热打击所致HUVECs的TEER降幅显著减小、Pa增幅显著减小,稳定了细胞通透性;2.3.SB203580预处理,Western Blot及免疫荧光均提示热打击引起的HUVECs中VE-Cadherin原"胞膜减少、胞浆增加"的重新分布趋势显著减轻;结论:热打击下HUVECs通透性呈温度时间依赖性增高,其VE-Cadherin随热打击发生从胞膜到胞浆的再分布。热打击早期即引起P38磷酸化,并通过p38 MAPK通路调控VE-Cadherin从胞膜到胞浆的移位,造成细胞间粘附连接的破坏,引起HUVECs通透性增高。