论文部分内容阅读
产羔率是山羊繁殖性状的重要指标之一,如何提高山羊产羔率一直是人们关注的热点。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)属于抗氧化剂,抗氧化作用极强,对胚胎发育、胚胎着床、抑制炎性等发挥重要的作用。NAC在提高山羊产羔率上具有重要作用,但其影响山羊产羔率的分子机制尚不清楚。本研究基于课题组前期子宫角转录组测序实验,筛选出IGF1、IGFBP1为目的基因,以努比亚山羊为对象,采用qRT-PCR检测在饲喂NAC后努比亚山羊性腺轴中IGF1、IGFBP1基因的表达情况;克隆IGF1、IGFBP1基因的CDS区,构建pEGFP-N3-IGF1,pEGFP-N3-IGFBP1真核表达载体;分离培养山羊子宫上皮细胞,检测不同浓度NAC对目的基因表达及子宫上皮细胞增殖的影响,确定NAC培养子宫上皮细胞的最适浓度;ELISA检测200μM NAC组对子宫上皮细胞中氨基酸含量的影响。将真核表达载体pEGFP-N3-IGF1,pEGFP-N3-IGFBP1成转染到子宫上皮细胞,检测超表达IGF1、IGFBP1基因后对山羊产羔性状相关基因及细胞增殖和氨基酸含量的变化情况。研究结果如下:1.qRT-PCR结果显示,IGF1、IGFBP1基因在空白组与NAC饲喂组的性腺轴组织中均有表达。组间比较发现,相对于空白组,NAC饲喂后IGF1、IGFBP1基因在子宫、输卵管、下丘脑、卵巢组织中达到极显著差(P<0.01),IGFBP1基因在垂体组织中达到差异显著(P<0.05)。2.qRT-PCR检测不同浓度NAC培养的子宫上皮细胞中IGF1、IGFBP1基因的表达水平情况,结果发现,相比空白组,IGF1基因在不同浓度中的表达均有提高,IGF1、IGFBP1基因在添加200μM NAC时表达量最高。CCK-8检测结果显示,在所有浓度梯度里,最佳培养子宫上皮细胞的NAC浓度为200μM。200μM NAC培养子宫上皮细胞后,ELISA检测发现,细胞中被检测的氨基酸含量均有增加,除谷氨酸和脯氨酸在12 h时与对照组未达到差异显著外,其余且均与对照组呈现极显著差异(P<0.01)。3.成功克隆了IGF1、IGFBP1基因CDS区,将回收纯化的两个基因的CDS区构建pEGFP-N3-IGF1、pEGFP-N3-IGFBP1真核表达载体,测序结果表明克隆的两个基因为山羊的IGF1、IGFBP1基因;生信分析发现,IGF1蛋白理论相对分子质量为16.95367 kD,等电点为9.3,不稳定系数为:53.19;IGFBP1蛋白理论相对分子质量为28.79201 kD,等电点为5.99,不稳定系数为:53.15。提示IGF1、IGFBP1蛋白均为不稳定蛋白;IGF1、IGFBP1同源性分析均与绵羊的遗传距离最近。4.qRT-PCR检测IGF1、IGFBP1基因的超表达效率,结果显示,转染重组质粒组细胞中IGF1、IGFBP1基因mRNA的表达水平均与PEGFP-N3组呈现极显著差异(P<0.01)。超表达IGF1基因后,IGF1与产羔性状相关基因的表达量与PEGFP-N3组呈现极显著差异(P<0.01);超表达IGFBP1基因后,IGFBP1、CXCL14、LHB、TGFβ1、PTGS2基因表达水平也极显著高于PEGFP-N3组(P<0.01),HOXA10、LIF基因表达显著高于与PEGFP-N3组(P<0.05)。CCK-8法检测超表达IGF1和IGFBP1基因对子宫上皮细胞的增殖影响,结果发现超表达IGF1和IGFBP1基因后在6 h、12 h、24 h、48 h时间内子宫上皮细胞的增殖效率均高于空载体组,且随着时间的增加细胞增殖效率越高。用ELISA试剂盒检测超表达IGF1和IGFBP1基因后,子宫上皮细胞中被检测的氨基酸在6 h、12h、24 h、48 h的含量都有增加,且均与空白对照组呈极显著差异(P<0.01)。