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溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）广泛分布于海洋和河口等处,属于嗜盐的革兰氏阴性条件致病菌,不仅可以感染鱼、虾、贝等多种水产经济生物,还能够引发人类的中耳炎、腹泻等疾病。弧菌往往借助鞭毛等器官产生运动,完成黏附、定植和侵袭等感染过程,并通过产生胞外多糖等物质促进生物膜的形成,增加该病原抵御不良环境和宿主免疫系统攻击的能力。在这些过程中,弧菌需要依靠多种感应系统监测并调节复杂的生理活动。其中,作为关键核苷类第二信使的四磷酸/五磷酸鸟嘌呤核苷酸（p）ppGpp扮演着重要的调控角色。然而,（p）ppGpp在溶藻弧菌应答环境胁迫和调控毒力中的作用尚不清晰。为此,本文以实验室分离保藏的一株致病性溶藻弧菌HN08155为研究对象,通过基因敲除与回补技术,得到（p）ppGpp代谢基因敲除株（ΔrelA,ΔrelAΔspo T）以及基因回补株（ΔrelA-p Rel A,ΔrelAΔspo T-p Spo T）,检测这些菌株在不同环境胁迫条件下的生长特性、毒力相关表型以及对凡纳滨对虾的毒力,率先深入研究（p）ppGpp对溶藻弧菌生存、生长和毒力的调控作用,为将来揭示溶藻弧菌的致病机理和制定相应的防控措施奠定理论基础。具体研究内容及结果如下:（1）开展了溶藻弧菌HN08155中（p）ppGpp代谢基因的序列分析。结果表明,在溶藻弧菌HN08155中存在两个调控（p）ppGpp代谢的基因,分别是序列长度为2220 bp的relA和序列长度为2121 bp的spo T。Rel A与其他弧菌蛋白序列的相似性为87%-97%,含有SYNTH结构域、TGS结构域和ACT结构域;Spo T与其他弧菌蛋白序列的相似性为91%-97%,含有HD结构域、SYNTH结构域、TGS结构域和ACT结构域。在Spo T的SYNTH结构域中存在保守的RXKD基序,而在Rel A的SYNTH结构域中存在保守的EXDD基序,表明Spo T对于GTP的亲和力可能更强;在Spo T的HD结构域中存在三个较为保守的基序,这对于水解（p）ppGpp尤为重要。因此,在溶藻弧菌中调控（p）ppGpp代谢的relA和spo T均相对保守,其中relA具有合成酶活性,而spo T既有合成酶也有水解酶活性。（2）测定了溶藻弧菌HN08155及其相关菌株在氨基酸饥饿和添加抗生素莫匹罗星条件下的生长特性。结果表明,在缺乏13种必需氨基酸的M9基本培养基中,与野生株（wild type,WT）和回补株相比,ΔrelA和ΔrelAΔspo T的生长能力均受到抑制;在M9基本培养基中补充13种必需氨基酸后,ΔrelA和ΔrelAΔspo T生长能力均得到恢复。在2216E培养基中添加3μg/m L的抗生素莫匹罗星后,与WT和回补株相比,ΔrelA和ΔrelAΔspo T逐渐停止生长并且死亡。因此,溶藻弧菌的relA在抵御氨基酸饥饿和抗生素莫匹罗星中发挥着重要作用。（3）测定了溶藻弧菌HN08155及其相关菌株在不同环境胁迫下的生长特性。结果表明,在胆汁盐、乙醇、温度变化和氧气压力等环境胁迫下,与WT、ΔrelA和回补株相比,ΔrelAΔspo T的生长能力均受到抑制。有趣的是,与WT、ΔrelA和回补株相比,在高温（37°C、42°C）和高浓度乙醇（3%）胁迫下,ΔrelAΔspo T的生长速度明显降低,而在低温（22°C）和低浓度乙醇（0.5%、1%）胁迫下,ΔrelAΔspo T的生长速度却显著提升。因此,溶藻弧菌的spo T在应答胆汁盐、乙醇、温度变化和氧气压力等环境胁迫中发挥着重要作用,但是在不同程度的胁迫条件下可能存在不同的调控机制。（4）检测了溶藻弧菌HN08155及其相关菌株的毒力相关表型和对凡纳滨对虾的毒力。结果表明,与WT和回补株相比,在低细胞密度下,ΔrelA和ΔrelAΔspo T的生物膜形成量均显著降低,在高细胞密度下,ΔrelA的生物膜维持一段时间较高的形成量后分解,而ΔrelAΔspo T的生物膜形成量一直处于较高的水平;在低细胞密度下,ΔrelA和ΔrelAΔspo T产生的胞外多糖均显著降低,在高细胞密度下,仅ΔrelAΔspo T产生的胞外多糖显著提升;ΔrelA和ΔrelAΔspo T均在液体培养基中呈现出明显的细胞凝集现象。与WT、ΔrelA和回补株相比,ΔrelAΔspo T不形成鞭毛,在琼脂平板上的游动圈和泳动圈直径均显著降低,产生不透明/褶皱菌落和气液交界面薄膜。人工感染试验结果表明,WT对凡纳滨对虾的半数致死量(50%lethal dose,LD50)为7.5×10~4CFU/g,ΔrelA和ΔrelAΔspo T的LD50值分别下降了30倍和60倍。因此,溶藻弧菌的relA和spo T均会影响生物膜形成、胞外多糖产生、细胞凝集能力和对凡纳滨对虾的毒力,spo T还会影响菌落形态、气液交界面薄膜产生、鞭毛形成和运动能力。（5）测定了溶藻弧菌HN08155及其相关菌株中毒力相关基因的表达量。结果表明,与WT相比,在低细胞密度下,ΔrelAΔspo T的胞外多糖相关基因vps T、vps H、vps M表达量均显著降低,而ΔrelA的vps T、vps H表达量显著降低,在高细胞密度下,ΔrelAΔspo T的胞外多糖相关基因表达量均显著提升;在低细胞密度下,ΔrelA的σ调控因子rpo N表达量显著提升,而ΔrelAΔspo T的rpo N表达量显著降低;在低细胞密度下,ΔrelA的运动相关基因che R、flg E表达量显著降低,而ΔrelAΔspo T的运动相关基因表达量均显著降低。因此,在低细胞密度下,溶藻弧菌的relA和spo T可以调节胞外多糖相关、运动相关和rpo N等基因的表达;而在高细胞密度下,主要通过spo T抑制胞外多糖相关基因的表达。综上所述,本文发现在溶藻弧菌HN08155中存在两个调控（p）ppGpp代谢的基因——主要应答氨基酸饥饿和莫匹罗星胁迫的relA,以及主要应答外界环境胁迫的spo T。这两个基因都参与了溶藻弧菌的毒力调控,其中spo T对于毒力及其相关表型的影响更加广泛而深刻。