目的：Legumain在肿瘤组织中呈现高度表达，本研究合成Legumain抗体-蒜酶偶联物，可以特异性识别肿瘤细胞，建立一种偶联物联合蒜氨酸原位释放大蒜辣素的类前药系统。首先建立分离分析合成原料-蒜酶提取物中二聚体与亚基的HPLC方法并对催化活性部分进行评价；然后合成前体物质Legumain抗体-蒜酶偶联物，研究偶联物对宫颈癌HELA细胞的体外靶向性以及偶联物联合蒜氨酸后原位产生的大蒜辣素对HELA细胞活性的抑制作用。
　　方法：1.采用SDS-PAGE法测定蒜酶提取物中蒜酶相对含量及其亚基分子量；建立SEC-HPLC法分离分析蒜酶二聚体和亚基方法，并应用于评价鲜蒜、大蒜冻干粉和蒜酶提取物中蒜酶的二聚体和亚基结构；建立蒜酶提取物中提取工艺中外加试剂PEG的HPLC含量测定方法。2.构建Legumain抗体替代物，牛血清蛋白-蒜酶偶联物的合成路线，采用凝胶电泳法和光谱法对偶联物进行表征，建立一种确定偶联物靶向性的免疫层析技术。3.确定Legumain抗体-蒜酶偶联物合成路线，采用流式细胞仪和激光共聚焦测定偶联物对HELA细胞的靶向性，MTT法测定Legumain抗体-蒜酶联合蒜氨酸原位产生大蒜辣素对细胞增殖的抑制作用；UPLC-MS/MS法测定偶联物联合蒜氨酸原位作用于HELA细胞后细胞内H2S的含量。
　　结果：1.SDS-PAGE结果表明，蒜酶提取物、大蒜冻干粉中蒜酶占总蛋白平均相对含量分别为50.20%、6.28%，蒜酶亚基平均分子量为50.88KDa。SEC-HPLC结果显示可以同时检测到蒜酶中二聚体和亚基结构，大蒜冻干粉和鲜蒜中均含有蒜酶二聚体和蒜酶亚基，其中二聚体峰面积与亚基峰面积比值分别是2.75±0.79（均值±SD，n=17）和3.01±0.84（均值±SD，n=7）；蒜酶提取物中蒜酶二聚体峰面积升高，亚基峰面积降低。HPLC测定不同批次蒜酶提取物中PEG杂质平均含量达46.14%。2.以牛血清蛋白替代Legumain抗体合成牛血清蛋白-蒜酶偶联物，经凝胶电泳法和光谱法对偶联物进行表征，确定了两种合成路线，并基于抗原-抗体识别功能采用免疫层析法确定牛血清蛋白-蒜酶偶联物靶向性。3.以优化的路线合成Legumain抗体-蒜酶偶联物，流式细胞仪检测结果显示，偶联物对HELA细胞具有靶向性；激光共聚焦观察结果显示，偶联物与细胞共培养1h时可以观察到偶联物富集在HELA细胞膜表面，5h时肿瘤细胞膜表面偶联物聚集增多，有些进入了细胞内部；MTT试验结果显示偶联物联合蒜氨酸在细胞原位的大蒜辣素，对HELA细胞增殖产生了抑制作用，当蒜氨酸浓度为468.954μM时细胞活力下降50%；UPLC-MS/MS测定结果显示，偶联物联合蒜氨酸作用细胞后，细胞内硫化氢含量较空白组显著升高了1.5倍，并随着蒜氨酸反应浓度的增大细胞内硫化氢含量随之升高。
　　结论：1.对偶联物的合成原料蒜酶提取物进行全面的质量分析和评价，首先采用SDS-PAGE法测定蒜酶的亚基分子量及其相对含量。考虑到蒜酶是二聚体蛋白的结构特殊性，SDS-PAGE法不能够检测蒜酶中二聚体的含量，所以实验建立SEC-HPLC法分别测定蒜酶的二聚体和蒜酶亚基相对含量，不同产地的大蒜中蒜酶二聚体和亚基含量有差异，已知蒜酶活力与其二聚体结构密切相关，为后续蒜酶提取纯化原料的选择及产品的分析提供了检测方法。PEG作为蒜酶提取工艺中加入的沉淀剂，实验建立HPLC法测定蒜酶提取物中PEG含量高达46.14%，不适宜作为药用原料使用，所以在后续蒜酶的提取纯化中应控制PEG加入量以及最终产品中PEG含量，为蒜酶提取纯化建立质量分析方法。2.实验以牛血清蛋白作为抗体替代剂合成牛血清蛋白-蒜酶偶联物，确定偶联物的合成条件和路线。成功合成Legumain抗体-蒜酶偶联物，确定偶联物对宫颈癌HELA细胞具有靶向性，偶联物中保留蒜酶活性与蒜氨酸共同作用后产生大蒜辣素对肿瘤细胞产生增殖抑制作用，偶联物联合蒜氨酸是通过H2S的介导产生的抑制肿瘤活性作用。采用免疫层析法应用于抗体-药物靶向性研究，替代体外细胞实验用于初步确定偶联物的靶向性。Legumain抗体-蒜酶偶联物的体外靶向性及活性试验为后续偶联物的体内药理活性研究奠定了基础。