侵染冬瓜的病毒种类鉴定及遗传多样性分析

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冬瓜是一种易栽培,经济价值高的蔬菜作物,近年来越来越受到农民的青睐。随着市场需求的增加,冬瓜的栽种面积逐年扩大,病毒病害也日益加重,引起严重的产量和质量损失。本研究从全国各主要冬瓜产区采集具有花叶、畸形等典型病毒病害症状的冬瓜病样,鉴定引起各地冬瓜病毒病害的病原种类,并对其CP基因核苷酸进行分析比较,为冬瓜抗病毒育种及病毒病的有效防控防提供理论依据。 本研究从以下几方面对冬瓜上的病毒病进行了初步研究:在子叶期分别接种5种葫芦科作物上常见的病毒病原,小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)分别接种在冬瓜上,观察和比较这5种病毒病原在冬瓜上的症状特征差异,发病时间及发病率,并以此作为后续研究中RT-PCR检测的阳性对照。其结果表明,这5种病毒均可侵染冬瓜,但不同病毒在冬瓜上的发病时间、发病率及症状存在明显差异:显症最早的是SqMV,最迟的是WMV;发病率普遍较低,都在30%以下,ZYMV的发病率仅为4%。 本研究选择4种常用的总RNA提取方法进行了冬瓜植株总RNA提取的比较。结果表明,过柱型试剂盒法能有效去除冬瓜叶片因保存时间过长而形成的色素,是提取冰冻冬瓜叶片总RNA的最佳方法。通过RT-PCR法,对从全国各主要冬瓜产区采集到的86份冬瓜病样进行了病毒病原检测。 根据报道的ZYMV、CMV、PRSV、WMV、SqMV的外壳蛋白基因序列设计特异引物,对86份材料进行了RT-PCR扩增,并从扩增产物中,按每地区选择1~2个阳性材料进行核苷酸序列测定。结果表明,通过这5对特异引物能在86份待检材料中可检测到ZYMV、WMV、CMV与PRSV四种病毒,尚未检测到SqMV。其中在番禺、三水、台山、英德及海南所采的样品中未检出ZYMV;在柯木朗、花都、清远、徐闻、海南及长沙地区采集的样品中未检出CMV;在番禺、陕西及清远采集的样品中未检出WMV。在各地区的样品中均能检出PRSV。同时还发现,在这些待检样品中四种病毒复合侵染现象较普遍,其中以PRSV与WMV组合最常见(12份),占复合侵染现象的30.77%;三种病毒复合侵染则相对较少(5份),其中有3份是ZYMV、WMV和PRSV组合;未发现有四种病毒复合侵染。 根据ZYMV的CP基因构建进化树,可划分为4个基因型,其中本研究获得8个阳性分离物,地区性不明显,初步认为分属于不同的株系;根据WMV CP基因构建的进化树,初步认为广东三水分离物(100和97)与广东柯木朗分离物(128)为同一株系,广东台山分离物(13)与广东柯木朗分离物(130)是一个同一个株系,广东英德分离物(104)与海南文昌分离物(133)是同一个株系;CMV按已有的报道可分为两个亚组,本实验的按CMV构建的进化树基本上与已有的报道相符,其中广东广州的这三个分离物属于Fny株系,其他分离物分属于不同株系,株系分化较多;根据PRSV的CP基因序列构建的进化树表明,本实验得到的各PRSV分离物具有丰富的多样性。
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