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背景与目的:少突胶质细胞（oligodendrocyte,OL）无法正常形成和髓鞘再生失败是多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）及其经典的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）病灶中髓磷脂发生进行性丧失的主要原因。OLs的分化成熟会受到细胞内在和外在因素相互作用,构成了复杂且精确的调控系统。经典的Wnt信号通路在OLs的发育过程,包括少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cell,OPC）的规格,OPC 分化,髓鞘化和髓鞘再生中发挥重要的信号调控作用。苦参素（matrine,MAT）,是一种从苦参等豆科植物中提取的喹诺酮类生物碱,具有有效抑制中枢神经系统（central nervous system,CNS）的炎症发生和促进神经再生的能力。在我们前期的研究中发现,MAT能够有效改善EAE小鼠的发病情况和临床神经功能学评分,并从保护血脑屏障、抑制炎症浸润、调节免疫功能及诱导神经营养因子分泌等多个途径阐明了苦参素的保护机制,但是对于MAT在少突胶质细胞形成和髓鞘再生方面目前暂未有深入的研究,此外关于MAT能否通过Wnt/β-catenin信号通路发挥髓鞘再生作用也未有研究。因而本文旨在探讨MAT对经典Wnt信号通路的调节机制,以及MAT能否通过促进OPCs分化为OLs从而促进髓鞘再生,本实验旨在为治疗MS找寻到可能的作用途径,并为临床上寻找有效治疗MS的新途径和方法提供可靠的理论支撑。方法:1 EAE小鼠模型建立方法无菌环境下将灭活的结核分枝杆菌溶液与MOG35-55等体积充分混合,搅打成油包水型抗原乳剂。对C57BL/6小鼠采取皮下三点法注射抗原乳剂,免疫后第0 h和第48 h时,将含200 ng的百日咳毒素经腹腔注入小鼠体内。2苦参素最佳剂量实验将30只免疫后的小鼠随机分为5组,注射等体积的生理盐水和4种不同剂量的 MAT（25 mg/kg/d、50mg/kg/d、100 mg/kg/d、200mg/kg/d）。采用双盲法进行神经功能评分,所有小鼠均干预至免疫后第23天。3动物分组将C57BL/6小鼠随机分成EAE模型组（EAE+Saline）、MAT治疗组（EAE+MAT）和正常组（Naive）。治疗组小鼠在免疫后第13天起每天给予50 mg/kg MAT进行腹腔注射治疗,正常组和模型组小鼠在免疫后的第13天起腹腔注射等体积的生理盐水,每日记录神经功能学评分,直至第23天停止。4收集实验标本免疫后第23天,麻醉小鼠并用生理盐水行心脏灌注,完整剥离脑和脊髓后将左脑和脊髓膨大处浸泡于4%多聚甲醛,右脑和剩余的脊髓冻存于-80℃冰箱。5指标检测小鼠脊髓组织的炎性细胞浸润情况采用苏木素-伊红（HE）染色法观察,小鼠脊髓组织的脱髓鞘情况则采用劳克坚牢蓝（LFB）髓鞘染色法观察,采用免疫荧光法来检测脑内海马和皮层区域MBP+、NF-H+的表达情况,采用免疫荧光双染法检测脑海马和皮层区域NG2+Olig2+、CC1+Olig2+、NG2+TCF7L2+的共表达,采用 Western Blot方法检测脑中蛋白 wnt3a、GSK3β、p-GSK3β、tota1β-catenin、p-β-catenin、active-β-catenin以及髓鞘碱性蛋白MBP表达,采用qRT-PCR法检测小鼠脑组织中Wnt3a mRNA和β-catenin mRNA的表达以及脑和脊髓中Cyclin D1 mRNA和Axin2 mRNA的表达情况。结果:1剂量探索实验在免疫后第23天,与模型组小鼠相比,25 mg/kg/d MAT治疗小鼠的临床评分略有下降,而50 mg/kg/d、100 mg/kg/d以及200 mg/kg/d MAT治疗组小鼠的临床评分均发生了显著了降低,50 mg/kg/d的MAT治疗剂量为最优剂量,并应用于后续的实验中。2神经功能学评分自第18天起,相比于Naive组小鼠,EAE+Saline组的临床评分出现统计学意义上的升高。第23天,经MAT治疗后,EAE+MAT组的神经功能学评分显著降低。此外,从免疫开始到处死期间,对累积神经功能学评分进行统计学分析,结果显示EAE+MAT组的评分显著低于EAE+Saline组小鼠。3组织病理学变化Naive组小鼠的脊髓状况良好,无病理变化。与Naive组小鼠相比,EAE+Saline组中存在的炎性浸润和脱髓鞘情况严重。经MAT治疗后的EAE+MAT组小鼠炎症浸润评分和脱髓鞘评分均显著低于EAE+Saline组。4髓鞘再生相关因子检测相比于EAE+Saline组小鼠,EAE+MAT组脑海马和皮质中MBP染色密度明显增加,此外,EAE+MAT组小鼠脑组织的MBP蛋白含量增加;EAE+MAT组小鼠脑海马和皮质中NF-H染色密度明显增加;EAE+MAT组小鼠脑海马和皮质中NG2和Olig2共染的少突胶质前体细胞数量明显减少而CC1和Olig2共染的成熟的少突胶质细胞数量明显增多;EAE+MAT组脑海马和皮层区域中NG2和Tcf712共染的阳性细胞数量明显减少。5 Wnt通路相关蛋白和靶基因检测相比于EAE+Saline组小鼠,EAE+MAT组脑组织中的Wnt3a、totalβ-catenin、active-β-catenin 以及p-GSK3β表达降低,此外,EAE+MAT组小鼠p-β-catenin、GSK3β蛋白表达水平表达出现增加;qRT-PCR结果显示,相比于EAE+Saline组小鼠,EAE+MAT组小鼠脊髓组织中的Wnt3a mRNA和β-catenin mRNA均发生降低,此外,EAE+MAT组小鼠的脊髓和脑组织中Cyclin D1 mRNA和Axin2 mRNA的表达水平均发生降低。结论:1 MAT治疗能显著缓解EAE小鼠的神经功能学状态,减轻CNS炎性细胞浸润和脱髓鞘的病理状况。2 MAT治疗作用可能通过抑制EAE小鼠体内异常升高的Wnt/β-catenin/Tcf712信号通路,从而促进少突胶质前体细胞分化成为少突胶质细胞和诱导髓鞘再生来发挥作用。3 MAT治疗作用可能通过增加GSK3β的表达,进而抑制EAE小鼠中Wnt信号通路的异常升高。