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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可导致人畜共患病弓形虫病,又称弓体病。弓形虫病呈世界性分布,据报道全球约三分之一的人口血清弓形虫抗体阳性。一项分析显示,我国普通人群弓形虫抗体阳性率为8.20%。普通人感染弓形虫多为自限性,少部分出现亚临床症状,此后长期呈隐匿性感染状态。但免疫抑制患者如肿瘤、艾滋等病人可导致不良预后。孕妇感染后可经胎盘传给婴儿导致先天性弓形虫病,严重者可导致流产、死胎。现我国孕妇优生优育产前TORCH五项检测中已包含弓形虫抗体检测。但弓形虫抗体检测无法准确的判断现状感染情况,为疾病的诊断与干预治疗带来不便。因此,开发具有诊断价值的弓形虫循环DNA和循环抗原（Circulating antigen,CAg）的检测方法显得尤为重要。本研究分别从弓形虫的循环DNA分子检测和循环抗原的免疫检测两部分进行探究。弓形虫的分子检测,主要以B1、529-RE（Repeat element）等多拷贝基因为靶点。其中529-RE在弓形虫基因组中有200-300拷贝数而被认为是最优的检测靶点。新型的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）可在1小时内将数个拷贝扩增至109,而被认为是一种可替代PCR扩增技术的高效分子扩增检测技术。本研究采用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和侧流试纸条（Lateral-flow-dipstick）结合,设计成为LAMP-LFD一体化核酸扩增检测装置。LAMP-LFD装置将常规LAMP扩增产物与核酸探针杂交,使分子产物检测转化为胶体金免疫检测,同时具有良好的密闭性而有效避免气溶胶污染,探索一种更为简单、高效、特异的弓形虫分子检测方法。弓形虫的抗原检测,主要以免疫学方法筛选制备特异性抗体检测膜表面抗原等弓形虫中丰都较高的靶标。弓形虫膜表面抗原1（Surface antigen 1,SAG1）在弓形虫速殖子表面高表达,被认为是最有价值的检测靶标之一。本研究中,采用骆驼科动物血清中天然存在的单重链抗体（Heavy chain antibodies,HCAb）的重链可变区,即纳米抗体（Nanobody,Nb）,结合噬菌体展示技术,筛选并制备抗弓形虫SAG1纳米抗体,为弓形虫循环抗原检测方法的建立奠定基础。目的1.建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,采用LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬血液样本中弓形虫进行检测,统计浙江省五市流浪猫犬中弓形虫阳性率。2.原核表达弓形虫SAG1抗原,免疫骆驼,构建弓形虫SAG1纳米抗体文库,淘选获得高亲和力的弓形虫SAG1纳米抗体,并表达鉴定。方法1.结合LAMP和LFD方法,优化反应体系,设计LAMP-LFD分子检测装置,建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,鉴定LAMP-LFD方法的特异性、灵敏度。2.利用建立的LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬的318份血液样本中弓形虫循环DNA进行检测,统计分析浙江省流浪猫犬中弓形虫阳性率。3.构建pET-28a-Sag1载体,原核表达弓形虫SAG1抗原,纯化、复性、鉴定后免疫骆驼,利用巢式PCR技术扩增骆驼淋巴细胞中VHH序列,构建抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。4.利用噬菌体展示技术,淘选抗弓形虫SAG1纳米抗体,并进行原核表达纯化,免疫杂交分析、鉴定。结果1.成功建立了LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE,通过LFD试纸条读取LAMP反应结果,可在1 h内最低检出1 fg弓形虫全基因组中的529-RE,且与猪隐孢子虫、利什曼原虫、间日疟原虫、溶组织内阿米巴、伊氏锥虫等寄生虫无交叉反应。建立的LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE序列的灵敏度是PCR是PCR方法的100倍。LAMP-LFD检测浙江省五座城市318例流浪猫犬血液样本中弓形虫,其中流浪猫血液样本105份,流浪犬血液样本213份,分别检出率为4.76%（5/105）、4.69%（10/213）。2.成功原核表达了弓形虫SAG1蛋白,并免疫骆驼,制备了3.2×108菌库库容的抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。通过噬菌体展示技术,筛选得到8个阳性的Anti-SAG1-Nbs,Western Blot显示均能与重组的弓形虫SAG1抗原反应。其中一株Anti-SAG1-Nb-5能同时与重组的弓形虫r SAG1抗原、天然弓形虫抗原反应,测定其与重组r SAG1抗原之间的亲和常数为1.66×10-9 mol/L。结论1.成功构建了弓形虫循环DNA的LAMP-LFD的分子诊断方法,具有良好的特异性和较高的灵敏度。该检测装置具备良好的气密性和便携性,适用于弓形虫的简便、高效的分子检测。2.利用LAMP-LFD方法对浙江省五市流浪猫犬血液中弓形虫进行检测,弓形虫检出率高于常规PCR方法。3.成功制备了弓形虫SAG1纳米抗体文库,并筛选、表达出具有高亲和力的纳米抗体,为弓形虫的抗原检测方法的建立奠定了基础。