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目前为止,在犬的精液冷冻保存方面,还没有形成一套成熟的冷冻保存方法。本实验以德国牧羊犬为研究对象,通过电镜对其鲜精超微结构进行观察研究,并分析超低温冷冻前后精子的超微结构的变化和顶体酶类活性的变化,探索适合德国牧羊犬精液冷冻保存的有效方法,并为其进一步优化提供理论依据,为犬精液冷冻产业化生产提供一定参考,促进犬精液冷冻技术的成熟。1.德国牧羊犬鲜精超微结构观察。将6只德国牧羊犬分别编为1-6号,其所采集的鲜精相应编为Ⅰ-Ⅵ组。将5次实验采集的30份鲜精分别进行品质检测。检查符合实验标准的鲜精每份各取500μl精液制作成扫描电镜样品和透射电镜样品,随机选取10-20个视野,观察200-300个精子；观察其形态特征,并拍照分析。结果显示：在扫描电镜下,精子整体呈“蝌蚪状”,头部呈扁卵圆形。在透射电镜下精子纵切面头部呈“楔形”,头部细胞膜由外向内分别由质膜、顶体外膜、顶体内膜和核膜组成。精子尾部中段横切面由外向内可见线粒体鞘膜、9束外周致密纤维,9对轴丝和2根中央微管。德国牧羊犬精子头长为5.40±0.12(μm),头宽3.26±0.02(μm),颈长1.25±0.01(μm),颈宽0.55±0.02(μm),尾部中段长11.34±0.03(μm),中段直径0.87±0.01(μm),尾部长55.70±0.22(μm),线粒体螺旋数为44±0.21(旋)。2.超低温冷冻对德国牧羊犬精子超微结构的影响。6组剩余鲜精分别进行离心(1000r/min,10min)、稀释(葡萄糖-卵黄-甘油,1：1)、平衡(4℃,2h)后,每份各取500μl制作成扫描电镜样品和透射电镜样品。其余平衡后精液制作成颗粒冻精(炸熏法),干解冻(38℃,30s)后将每份冻精制作成扫描电镜样品和透射电镜样品。随机选取10-20个视野,观察200-300个精子；观察精子各超微结构形态特征和大小拍照并记录数据。结果显示：鲜精和冻前精子头部、颈部和尾部形态变化差异均不显著(P>0.05)。超低温冷冻后精子头部、颈部和尾部发生形态变化的精子数极显著高于鲜精和冻前精子(P<0.01)。冻后顶体发生明显形态变化的精子占54.21%,高于发生颈部形态变化(10.61%)和尾部形态变化(28.83%)的精子数。3.超低温冷冻对德国牧羊犬精子顶体酶类(HYD、ACE和ACP)活性的影响。检测鲜精和冻精HYD、ACE和ACP活性,并进行比较。结果显示：冻后精子3种顶体酶类活性比鲜精极显著降低(P<0.01)。4.顶体酶类活性与精子活率、顶体完整率和畸形率的相关性。检测30份冻精的活率、顶体完整率和畸形率,并分别与其冻后顶体酶类活性进行相关性分析,结果显示：解冻后精子3种顶体酶类活性分别与精子活率和顶体完整率呈正相关,其中ACE活性与顶体完整率呈极显著正相关,相关系数r为0.487(P<0.01)。3种顶体酶类活性与畸形率均呈显著负相关(P<0.05)。ACE活性与精子顶体完整率的相关系数r为0.487,相关度高于HYD(0.439和0.459)和ACP(0.440),而HYD活性与精子活率的相关系数r为(0.404和0.423),相关度高于ACE(0.377)和ACP(0.369)。由以上结果可知,超低温冷冻主要引起精子头部膜结构特别是顶体的损伤,从而导致顶体内各种顶体酶类的流失及活性降低。