目前，体外成熟的猪卵母细胞主要存在着核、质成熟不同步，细胞质成熟差，体外受精后多精子受精率高和胚胎发育能力低等问题。本试验目的是通过比较不同方法(物理方法：完整卵泡腔培养、卵泡壁贴壁培养和卵泡液共培养；化学方法：推迟与促性腺激素接触培养和添加四种不同化学抑制剂培养)对猪卵母细胞内生发泡染色质构型、极体出现比率、卵丘扩散程度和孤雌激活后卵裂率的影响，以期建立一种能够模拟体内卵泡环境的猪卵母细胞体外培养体系，延缓猪卵母细胞生发泡破裂时间，抑制核体外自发成熟，使卵母细胞核、质成熟同步化，从而提高猪成熟卵母细胞的质量和发育同步化水平。研究中围绕着卵母细胞核和质成熟前后的相关变化，应用荧光染色与压片技术显微观察卵母细胞内生发泡染色质构型的变化情况：通过核相判定方法将卵母细胞的核相分为待成熟受抑制状态的生发泡(Germinal vesicle，GV)期(根据发育程度进一步细分为GVⅠ期-GVⅣ期)和进入成熟状态的生发泡破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)和之后的减数分裂(Meiosis，M)期(分为MⅠ期和MⅡ期，MⅠ进一步细分为中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ)，以生发泡染色质构型、卵丘扩散程度、核成熟率和孤雌激活后卵裂率为主要检测统计指标，得到以下的试验结果：试验一：比较不同物理方法对猪卵母细胞体外成熟效果的影响。将猪卵母细胞先用完整卵泡腔培养、卵泡壁贴壁培养、卵泡液共培养三种不同的物理方法培养24h后再移入常规培养液中继续培养18-21h，成熟卵母细胞用离子霉素孤雌激活，观察统计卵母细胞生发泡染色质构型、卵丘扩散程度、核成熟率和孤雌激活后卵裂率。1．完整卵泡腔培养、卵泡壁贴壁培养、卵泡液共培养及常规培养24h后，对卵母细胞进行核相判定并观察卵丘扩散情况，试验结果为：处于GV期的卵母细胞比例分别为：90.70％(78／86)、38.85(33／84)、28.75％(23／80)、65.22％(54／83)，其中完整卵泡腔培养极显著的延缓了卵母细胞生发泡破裂，该组处于GV(GVⅠ-GVⅡ)期的卵母细胞比例极显著的高于其他各培养组(p＜0.01)。完整卵泡腔培养24h后对卵母细胞发生卵丘扩散的抑制作用较强，未发生卵丘扩散的卵母细胞比例极显著的高于常规培养组(p＜0.01)，其对卵母细胞卵丘发生1-2级扩散无显著影响(p＞0.05)，对卵丘发生3-4级扩散有极显著的抑制作用(p＜0.01)。2．将卵母细胞置于完整卵泡腔内培养分别培养24h、48h、96h、168h之后，再在常规IVM培养液中继续培养24h后荧光染色，对其进行核相判定，结果表明：完整卵泡腔前培养组去除抑制后的卵母细胞恢复减数分裂的能力较强，处于GVBD-MⅡ期的卵母细胞为71.80％(56／78)，极显著高于其他各组(p＜0.01)。随着完整卵泡腔前培养时间的增长，处于GV期的卵母细胞比例逐渐增长，其中处于GVⅠ-GVⅡ期和GVBD-MⅡ期的卵母细胞比例逐渐减少，卵母细胞的退化率逐渐升高，说明前培养时间过长会使卵母细胞的核成熟率下降。3．将三种物理方法前培养24h后的卵母细胞移入常规IVM培养液中继续培养18-21h，将成熟的卵母细胞孤雌激活，分别于培养的第2d和第5d观察卵母细胞的卵裂率和8-cell及以上胚胎的比例。完整卵泡腔前培养组的成熟率、卵裂率及8-cell及以上的胚胎比例显著的高于卵泡壁贴壁培养组和卵泡液共培养组(p＜0.05)，说明与其他两种物理方法比，完整卵泡腔培养在核质成熟同步化基础上，提高了卵母细胞的发育能力；与常规培养组相比，完整卵泡腔培养使卵母细胞的核质同步化水平得到了提高，但未使其发育能力得到提高。试验二：推迟与促性腺激素接触对猪卵母细胞体外成熟效果的影响。将猪卵母细胞分别在无激素IVM培养液及添加了促性腺激素PMSG和HCG的IVM培养液培养24h后，再分别移入添加了促性腺激素PMSG和HCG的IVM培养液及无激素IVM培养液中继续培养18-21h，成熟卵母细胞用离子霉素孤雌激活，观察统计卵母细胞生发泡染色质构型、卵丘扩散程度、核成熟率和孤雌激活后卵裂率。1．卵母细胞分别在无激素IVM培养液及添加促性腺激素PMSG和HCG的IVM培养液培养24h后对卵母细胞进行核相判定并观察卵丘扩散情况。试验结果：无激素前培养组、有激素前培养组和常规培养组处于GV期的卵母细胞比例分别为86.67％(78／90)、39.13％(36／92)、28.75％(23／80)，无激素前培养后停滞在GV期的卵母细胞比例极显著的大于其他两组(p＜0.01)。有激素前培养组卵丘3-4级扩散的比例极显著高于无激素前培养组(p＜0.01)，表明激素能够促进卵丘的扩散。2．将无激素前培养24h后的卵母细胞转移到添加了促性腺激素PMSG和HCG的IVM培养液中再培养18-21h，同时将有激素前培养的卵母细胞转移到无激素IVM培养液中再培养18-21h，将两组卵母细胞荧光染色，观察其核成熟情况，结果表明：无激素前培养24h后76.32％(58／76)的卵母细胞减数分裂恢复至GVBD-MⅡ期，其比例高于有激素前培养组72.60％(53／73)，但差异不显著(p＞0.05)。3．将两组成熟的卵母细胞孤雌激活，分别于培养的第2d和第5d观察卵母细胞的卵裂率和8-cell及以上胚胎的比例。无激素前培养组的成熟率、卵裂率及发育至8-cell及以上的胚胎比例高于有激素前培养组，但是差异不显著(p＞0.05)。结果表明：与有激素前培养相比，无激素前培养能够使卵母细胞的发育能力得到提高，但效果不显著；无激素前培养组体外成熟效果较常规培养组差，未能提高卵母细胞的发育能力。试验三：不同化学抑制剂前培养对猪卵母细胞体外成熟效果的影响。将猪卵母细胞培养于含不同抑制剂的常规IVM培养液中24h，再移入常规IVM培养液继续培养18-21h，成熟卵母细胞用离子霉素孤雌激活，观察统计卵母细胞生发泡染色质构型、卵丘扩散程度、核成熟率和孤雌激活后卵裂率。1．将卵母细胞分别在含4mmol／L次黄嘌呤(Hypoxanthine，HX)、50μmol／L ROS(Roscovitine)、2μg／ml放线菌酮(Cycloheximide，CHX)、2mmol／L 6-二甲氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)和不含抑制剂的常规IVM培养液中前培养24h后，对卵母细胞进行核相判定并观察卵丘扩散情况。培养前(0h时)，92.22％(83／90)卵母细胞处于GV期，加入不同化学抑制剂培养24h后，HX组、ROS组、CHX组、6-DMAP组及无抑制剂组处于GVⅠ-GVⅡ期的卵母细胞比例分别为：83.75％(67／80)，89.02％(73／82)，89.87％(71／79)，82.14％(69／84)，28.75％(23／80)。ROS组和CHX组处于GVⅠ-GVⅡ期的卵母细胞比例显著大于其他三组(p＜0.05)，结果表明：当加入不同化学抑制剂后，延缓了卵母细胞生发泡破裂时间。ROS组未扩散的卵母细胞比例极显著高于其余各组(p＜0.01)，而ROS组的卵母细胞发生3-4级扩散的比例极显著的低于其他组(p＜0.01)。结果表明：ROS抑制卵丘扩散的作用最强，HX和6-DMAP抑制卵丘扩散的作用较弱，培养液中含有化学抑制剂能在一定程度上抑制卵母细胞卵丘的扩散。2．在含不同抑制剂IVM培养液前培养24h后，将卵母细胞转移到常规IVM培养液中再培养18-21h，荧光染色，观察其核成熟情况：HX组、ROS组、CHX组、6-DMAP组及无抑制剂组中处于GVBD-MⅡ期的卵母细胞比例分别为：78.79％(52／66)，86.57％(58／67)，87.69％(57／65)，52.17％(36／69)，88.24％(60／68)，其中无抑制剂组、ROS组和CHX组中处于GVBD-MⅡ期的卵母细胞比例极显著的大于其他两组(p＜0.01)，说明ROS和CHX能够可逆的抑制卵母细胞的减数分裂，去除抑制后减数分裂进程得以恢复。3．将不同抑制剂前培养24h后的卵母细胞移入常规IVM培养液中继续培养18-21h，将成熟的卵母细胞孤雌激活，分别于培养的第2d和第5d观察卵母细胞的卵裂率和8-cell及以上胚胎的比例。ROS组、CHX组和无抑制剂组的成熟率差异不显著(p＞0.05)，但上述三组与HX组和6-DMAP组的成熟率差异显著(p＜0.05)，ROS组的卵裂率及8-cell及以上的胚胎比例最高。结果表明：ROS前培养24h能够在不影响卵母细胞发育能力的情况下使卵母细胞核质同步化水平得到提高。结论：1．与卵泡壁贴壁培养及卵泡液共培养相比，完整卵泡腔前培养24h能使猪卵母细胞停滞于GV期，去除抑制后的卵母细胞恢复减数分裂的能力较强，在核质成熟同步化基础上，提高了卵母细胞的发育能力，极显著的抑制了卵母细胞的卵丘扩散，前培养时间过长会使卵母细胞的核成熟率下降，退化率逐渐升高。2．与有激素前培养相比，无激素前培养能够使卵母细胞的核成熟率及发育能力得到提高，但效果不显著，同时抑制了卵丘的扩散；与常规培养相比，无激素前培养组体外成熟效果较差，卵母细胞的发育能力降低。3．HX、ROS、CHX和6-DMAP均能可逆性地抑制卵母细胞的减数分裂，其中ROS抑制减数分裂的能力较强，添加ROS 24h后移入常规培养液继续培养，卵母细胞减数分裂得以恢复，能够在不影响卵母细胞发育能力的情况下使卵母细胞核质同步化水平得到提高，ROS抑制卵丘扩散的作用最强，HX和6-DMAP抑制卵丘扩散的作用较弱，培养液中含有化学抑制剂能在一定程度上抑制卵母细胞卵丘的扩散。总之，在猪卵母细胞体外培养的早期，抑制核的自发成熟，延缓生发泡破裂时间，可以使卵母细胞核质同步化成熟，并提高其发育能力。比较物理和化学方法延缓生发泡破裂时间对卵母细胞体外成熟效果的影响，发现添加化学抑制剂ROS前培养能够在不影响卵母细胞发育能力的情况下使卵母细胞核质同步化水平得到提高，完整卵泡腔培养的效果次之，推迟与促性腺激素接触时间培养效果较差。