野生鼠兔与鸡H9N2亚型流感病毒的分离与遗传进化分析

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禽流感(avian influenza),是由A型流感病毒引起的一种从呼吸系统疾病到严重全身性败血症的传染性疾病。根据禽流感病毒的致病性强弱,可将禽流感分为高致病性禽流感(HPAI)、低致病性禽流感(LPAI)和无致病性禽流感(NPAI)3种。其中高致病性禽流感(HPAI)已经被国际兽医局(OIE)列为1类烈性传染病。禽流感病毒在全球广泛分布,宿主范围广,多种鸟类均可感染。现已证实,禽流感病毒广泛分布于世界范围内的许多家禽(包括鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、石鸡、雉、鸵鸟、鹅和鸭)和野禽(包括野鸭、天鹅和各种野鸟等),覆盖88种22科。某些情况下,禽流感也会突破种属特异性,感染猪、马、鲸鱼、雪貂等不容动物。尤其是禽流感病毒可能直接感染人,如H5、H7和H9亚型,并造成人的死亡。   高原鼠兔是新发现的一种A型流感病毒的宿主,目前仍不清楚其在流感病毒传播过程中所起的作用。本研究对青海省内的高原鼠兔进行了禽流感流行病学调查,在2008-2009年间,分别从青海省内14个不同的地区捕捉了138只鼠兔,采集了130份血清和817份组织样品。通过血凝抑制试验,运用H1-H13禽流感标准抗原检测鼠兔血清,结果在鼠兔中检测到有抗H1和H3亚型流感病毒的低水平抗体(≤3log2),其中H3的反应率为15.3%,H1的反应率为0.8%。   通过鸡胚传代接种,我们从鼠兔和鸡的组织样品中各自分离到1株H9N2亚型流感病毒。鼠兔分离病毒在第一和第二代传代鸡胚尿囊液中未检测到血凝现象,而在在第三代死胚中检测到HA效价。鸡的H9N2病毒分离自有典型流感症状的蛋鸡。在蛋鸡的肺脏、泄殖腔拭子和气管拭子中都分离到了该H9N2病毒,且表现出了较高的血凝效价。   利用RT-PCR技术分别扩增了分离的2株H9N2流感病毒基因组的8个基因片段,将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定,并将所测片段与GenBank中的相应序列进行比对,绘制系统进化树,并进行基因型分析。结果显示:所克隆的基因片段均含有病毒基因完整的开放阅读框,A/Pika/Menyuan/01/2008与A/Turkey/Wisconsin/1/1966进化距离最近,而A/Chicken/Jiande/01/2009与A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007进化距离最近。系统进化树显示A/Pika/Menyuan/01/2008属于美洲谱系,而A/Chicken/Jiande/01/2009是源自Ck/SH/F/98的重组毒株。氨基酸序列分析显示2株病毒均有弱毒的分子特征,而鸡静脉指数(IVPI)和鸡胚半数致死量(EID50)的测定也证实了这一结果。
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