论文部分内容阅读
虎纹蛙病毒(TFV)是使养殖虎纹蛙(Ranatigrinarugulosa)和中华鳖(Trionyxsinensis)发病致死的主要病原，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)、蛙病毒属(Ranavirus)(Heetal.，2002)。TFV给虎纹蛙和中华鳖的养殖带来巨大经济损失，弄清其侵染机理是有效防治的基础。
本实验使用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的方法在细胞水平上对TFV部分基因致细胞病理变化(CPE)进行了研究。
RNAi是一种新的并极为有效的基因沉默研究方法，将体外转录合成的siRNA(smallinterferingRNA)转染至TFV敏感细胞系——胖头鱼肌细胞(musclecelloffatheadminnow，FHM)，并用TFV攻毒细胞；通过观察RNA干扰后不同时间点细胞病理变化、半定量RT-PCR检测基因表达量的变化及检测病毒滴度的变化等方法分析相关基因被沉默后对病毒复制、病毒基因表达的影响。本论文选择了5个基因进行特异性干扰。分别是与病毒复制相关的3个基因ORF009-—解旋酶基因(helicase)，ORF089——胞嘧啶DNA甲基转移酶基因(cytosineDNAmethyltransferase，DMet)和ORF101DNA修复蛋白基因(RAD-2)，推定的UTP酶/类解旋酶蛋白(ORF078)以及可能是结构蛋白的ORF001。
此外，运用相同的方法共对TFV的32个基因进行了RNA干扰筛查，为进一步分析TFV基因中与病毒侵入和复制相关基因的功能和发现其他基因的新功能打下基础。
实验数据表明，在被干扰的32个基因中初步筛选出与病毒致病力相关的9个基因，分别是ORF001、ORF012、ORF072、ORF073、ORF075、ORF081、ORF088、ORF089和ORF101。
本论文选择的5个功能基因特异性siRNA在细胞水平上显著地降低了目的基因的表达量，相关基因被抑制后CPE出现时间推迟，病毒滴度下降明显。与未转染特异性siRNA的各组对照相比，在感染病毒后的60h内细胞病理变化推迟18h-36h出现，感染后第60h病毒滴度TCID50值比阳性对照降低101.33104.33倍。