高碳酸血症是重症监护病房(intensive care unit,ICU)中合并有呼吸系统疾病的重症疾病的重要特征,慢性阻塞性肺疾病急性加重期、重症肺炎、严重急性哮喘都可能出现高碳酸血症,临床中发现这部分患者出院后均不同程度的存在认知功能障碍。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARD S)中采取的小潮气量的肺保护性策略减少了患者的病死率,但这样的通气策略通常会引起高碳酸血症。既往的流行病学调查显示:存活的ARDS患者中,出院时有70%-100%的人存在着认知功能障碍,1年后仍有46%-80%,5年后降至20%。重症患者出院后出现的注意障碍、记忆障碍、执行功能障碍等各种认知功能障碍可以导致患者回归社会后的生活自理能力严重下降,这给患者自身、家庭、社会带来了及其严重的经济负担。血脑屏障通透性(BBB)的增加是神经认知功能损伤加重的重要机制。正常情况下,BBB给中枢神经系统提供了安全的环境,使其免于外界病原体以及毒素的侵袭。而BBB通透性的增高,易于引起外周的炎症因子、神经毒性物质透过BBB进入中枢系统引起认知功能的损害。BBB是由无窗孔的毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接(TJs)、基膜、周细胞、神经元细胞、星形胶质细胞足突和极狭小的细胞外隙共同组成的一个细胞复合体。BBB中星形胶质细胞通过其的终足与周围的周细胞、神经元细胞、内皮细胞紧密联系。星形胶质细胞主要通过分泌活性物、基因的转录和蛋白质的合成协同作用参与BBB的维持与形成。星形胶质细胞主要通过调控水通道蛋白4(AQP-4)以及基质金属蛋白酶(MMPs)的表达来调整BBB的通透性。在低氧条件下,由于星形胶质细胞AQP-4水平表达的上调,可以导致BBB通透性的增加从而加重脑水肿。同样在缺血缺氧的大鼠模型中,星形胶质细胞主要通过分泌MMP-9,从而导致脑微血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白(Tjps)破坏,增加血脑屏障的通透性。因此AQP4以及MMP-9的表达跟BBB通透性密切相关。缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的与低氧放应原件结合、具有转录活性的核蛋白,在机体缺氧代偿性反应过程中能发挥重要作用。HIF-1是一种异源二聚体,主要由120kD的HIF-1 α和91～94kD的HIF-1 β两个亚单位组成。HIF-1 β亚基在细胞浆中稳定表达,起结构性作用。HIF-1 α是HIF-1的活性亚基,受缺氧信号的调控,HIF-1 α亚基在翻译后即被泛素一蛋白酶水解复合体降解,因此在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到HIF-1α亚基的表达;而在缺氧状态下,HIF-1 α亚基的降解被抑制,1α和β亚基形成有活性的HIF-1,转移到细胞核内与低氧放应原件结合,调节多种基因的转录,从而参与各种器官或组织的缺氧缺血性损伤及其修复过程。在缺氧,缺血再灌注以及炎症过程中HIF-1信号通路的激活可以引起BBB通透性的增加。而在小鼠脑创伤的模型中亦发现,HIF-1信号转导通路可以通过上调AQP-4以及MMP9的表达从而引起BBB通透性的增加以及脑水肿。但是在低氧情况下,HIF-1信号转导通路是否进一步受高碳酸血症的调节,从而进一步上调中枢神经系统中星形胶质细胞中AQP-4以及MMP9的表达,进而导致BBB的破坏,最终引起认知功能的损害,目前未有相关文献报道。本研究在机械通气条件下制造低氧和(或)高碳酸血症的SD大鼠模型,通过水迷宫(Morris water maze,MWM)实验评估SD大鼠的神经认知功能;伊文思蓝(Evans blue,EB)实验以及测定大鼠脑组织含水率评估血脑屏障功能;予以Western Blot以及免疫双荧光法检测SD大鼠海马区星形胶质细胞中HIF-1a总蛋白以及核蛋白的表达情况,进一步检测AQP-4以及MMP9的表达变化及Tjps(occludin、claudin-5)的表达变化。其次,我们予以甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol:2ME2,HIF-1α核转位的抑制剂)对低氧合并高碳血症组进行干预,探索高碳血症对星形胶质细胞中HIF-1α蛋白核转录易位以及下游调控蛋白AQP-4以及MMP9的表达变化的影响。最终,我们予以三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)中和高浓度CO2导致的酸性环境,观察Tris-base去除酸性环境后对星形胶质细胞中HIF-1α蛋白核转录易位以及下游调控蛋白AQP-4以及MMP9的表达变化的影响。本研究分为五个章节去探讨其中的机制:第一章低氧合并(或)高碳酸血症对实验大鼠神经认知功能的影响目的:在机械通气条件下制造低氧和(或)高碳酸血症的SD大鼠模型,通过左股动脉抽取大鼠动脉血样本,行血气分析,明确SD大鼠低氧/高碳酸血症模型的最优O2浓度和CO2,浓度;行MWM实验评估低氧/高碳酸血症对SD大鼠时空记忆能力的影响。方法:根据SD大鼠的公斤体重,以戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射进行深度麻醉,口腔入路气管插管,套管接动物专用呼吸机,行机械通气。通过调整呼吸机气缸中气体的成分比例,可将大鼠按照随机化原则分成4组:假手术组(Sham operation/S组:普通空气条件)、低氧血症组(Hypoxemia/H组:84%N2+16%O2)、高碳酸血症组(Hypercapnia/HC 组:74%N2+21%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组(Hypoxemia and Hypercapnia group/HH group:79%N2+16%O2+5%CO2)。各组在机械通气过程中,30min、60min、120min、180min抽取血气样本,分析O2分压(PO2)、CO2分压(PCO2)和酸碱度(pH)值。调整呼吸机气缸中气体O2、CO2以及N2浓度的比例,达到模拟临床实际低氧合并高碳酸血症的目的。MWM实验中,通过测定SD大鼠的逃逸潜伏期,评估低O2合并(或)高CO2是否对SD大鼠时空记忆能力产生损害。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析;使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果:S组和H组,PCO2维持在35-45 mmHg之间,HC组和HH组PCO2值维持在60-69 mmHg之间,与此对应的pH值维持在7.20-7.25之间。予以5%CO2干预HC组以及HH组可以显著升高PCO2值(30min、60min、120min、180min:所有P<0.01),同时降低 PH 值(30min、60min、120min、180min:所有P<0.01)。H组和HH组PO2值维持稳定在60 mmHg附近。予以16%O2干预可以显著降低 PaO2 值(30min、60min、120min、180min:所有P<0.01);MWM实验中,低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应(48 h、72 h:所有P<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,逃逸潜伏期之间的差异无显统计学意义(48 h、72 h:所有P>0.05),而H组逃逸潜伏期显著长于S组(48 h、72 h:所有P<0.05),HH组逃逸潜伏期显著长于H组(48h、72 h:所有P<0.05)以及HC组(48 h、72 h:所有P<0.05)。结论:1、通过机械通气的方式,成功模拟与临床相符合的低氧合并高碳酸血症的SD大鼠实验模型。2、单纯的高碳酸血症并不会引起大鼠的神经认知功能障碍3、高碳酸血症可以进一步加重低氧血症大鼠的神经认知功能障碍。第二章 低氧合并(或)高碳酸血症对实验大鼠血脑屏障功能的影响目的:探索低氧合并(或)高碳酸血症对SD大鼠脑组织含水率以及伊文思蓝渗漏量的影响,以此评估大鼠血脑屏障功能。方法:将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham operation/S组:普通空气条件)、低氧血症组(Hypoxemia/H组:84%N2+16%O2)、高碳酸血症组(Hypercapnia/HC 组:74%N2+21%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组(Hypoxemia and Hypercapnia group/HH group:79%N2+16%O2+5%CO2)。上述各组予以机械通气3小时后获取脑组织。SD大鼠的脑组织含水率计算如下:%H2O=(湿重-干重)/湿重× 100%。而伊文思蓝的渗漏量则通过分光光度计去检测SD大鼠脑组织在620nm波长处的吸光度,根据绘制的EB标准曲线计算EB含量。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析;使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果:1、在BWC测定实验中,低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(BWC:p<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠脑组织含水率之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组SD大鼠脑组织含水率显著长于S组(P<0.05),HH组SD大鼠脑组织含水率显著长于H组(P<0.05)以及HC组(P<0.05)。2、在EB渗漏测定实验中,低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(EB:p<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠伊文思蓝渗漏量之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组SD大鼠伊文思蓝渗漏量显著长于S组(P<0.05),HH组SD大鼠伊文思蓝渗漏量显著长于H组(P<0.05)以及HC组(P<0.05)。结论:1、单纯的高碳酸血症并不会引起大鼠的大鼠血脑屏障的破坏。2、高碳酸血症可以进一步加重低氧血症大鼠的血脑屏障的破坏。第三章 低氧合并(或)高碳酸血症对实验大鼠大脑海马区血脑屏障HIF-1a-AQP-4/MMP-9信号通路相关蛋白以及紧密连接蛋白的影响目的:探索低氧合并(或)高碳酸血症对SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞HIF-1a总蛋白以及核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达及其紧密连接蛋白occludin、claudin-5蛋白的影响。方法:将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham operation/S组:普通空气条件)、低氧血症组(Hypoxemia/H组:84%N2+16%O2)、高碳酸血症组(Hypercapnia/HC 组:74%N2+21%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组(Hypoxemia and Hypercapnia group/HH group:79%N2+16%O2+5%CO2)。上述各组予以机械通气3小时后获取大脑海马区组织。采用Western Blot法检测各组SD大鼠大脑海马组织中HIF-1 a总蛋白以及核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白、occludin蛋白、claudin-5蛋白。采用免疫双荧光法检测SD大鼠大脑海马组织中HIF-1a蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白与星形胶质细胞(GFAP标记)共定位表达。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析;使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果:1、Western Blot 实验提示:1.1 HIF-1a总蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间不存在交互作用效应(p>0.05);HIF-la核蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(p<0.05),进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠大脑海马区HIF-1a核蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组SD大鼠大脑海马区HIF-1a核蛋白表达水平显著长于S组(P<0.05),HH组SD大鼠大脑海马区HIF-1a核蛋白表达水平显著长于H组(P<0.05)以及 HC 组(P<0.05)。1.2 AQP-4蛋白、MMP-9蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(AQP-4蛋白:p<0.05;MMP-9蛋白:p<0.05),进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠大脑海马区AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(AQP-4蛋白:P>0.05;MMP-9蛋白:P>0.05),而H组SD大鼠大脑海马区AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平显著长于S组(AQP-4蛋白:p<0.05;MMP-9蛋白:p<0.05),HH组SD大鼠大脑海马区AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平显著长于H组(AQP-4蛋白:p<0.05;MMP-9 蛋白:p<0.05),以及 HC 组(AQP-4 蛋白:p<0.05;MMP-9 蛋白:p<0.05)。1.3紧密连接蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(occludin蛋白:p<0.05;claudin-5蛋白:p<0.05),进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义((occludin蛋白:P>0.05;claudin-5蛋白:P>0.05),而H组SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平较S组显著减少(occludin 蛋白:P<0.05;claudin-5 蛋白:P<0.05),HH 组 SD 大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平显著少于H组(occludin蛋白:p<0.05;claudin-5 蛋白:p<0.05),以及 HC 组(occludin 蛋白:P<0.05;claudin-5 蛋白:p<0.05)。2、免疫荧光双标实验提示:2.1 HIF-1a核蛋白:单纯高碳酸血症不能引起SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞核内HIF-1a核蛋白表达增加,而予以低O2(16%)干预,可明显上调H组海马区星形胶质细胞核内HIF-1a核蛋白的表达。予以低O2(16%)和高CO2(5%)干预,可以进一步提高HH组SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞核内HIF-1a核蛋白表达。2.2 AQP-4蛋白、MMP-9蛋白:单纯高碳酸血症不能引起SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞核内AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达增加,而予以低O2(16%)干预,可明显上调H组海马区星形胶质细胞核内AQP-4蛋白、MMP-9蛋白的表达。予以低O2(16%)和高CO2(5%)干预,可以进一步提高HH组SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞核内AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达。结论:1、单纯的高碳酸血症并不会引起大鼠大脑海马区星形胶质细胞中HIF-1a总蛋白以及核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平的变化,并且也不会引起海马区血脑屏障紧密连接蛋白occludin、claudin-5的降解。2、高碳酸血症不能增加低氧血症大鼠大脑海马区星形胶质细胞HIF-la总蛋白的表达,但可以进一步增加低氧血症下海马区星形胶质细胞中HIF-1a核蛋白的表达。3、高碳酸血症可以进一步增加低氧血症大鼠大脑海马区星形胶质AQP-4蛋白、MMP-9蛋白的表达水平,同时会进一步增加海马区血脑屏障紧密连接蛋白occludin、claudin-5 的降解。第四章 高碳酸血症对低氧大鼠大脑海马区星形胶质细胞HIF-1a蛋白核转入易位以及AQP-4、MMP-9、occludin以及claudin-5蛋白表达的影响。目的:探索低氧合并(或)高碳酸血症对低氧血症大鼠大脑海马区星形胶质细胞HIF-1a蛋白核转入易位以及AQP-4、MMP-9、occludin以及claudin-5蛋白表达的影响。方法:1.药物配置1.1甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol:2ME2,HIF-1α核转位的抑制剂)首先将2ME2溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,进一步在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行稀释,最终稀释的体积为2ml。2ME2组在机械通气前1小时给予抑制剂(5mg/kg,腹膜内注射)1.2对照载体(Vehicle)将DMSO在PBS中进行稀释,最终稀释成体积为2ml的对照载体。2、分组以及药物干预2.1将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组(S组:普通空气条件)、低氧血症组(H 组:84%N2+16%O2)、高碳酸血症组(HC 组:74%N2+21%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组(HH group:79%N2+16%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组+2ME2。其中S组、H组、HC组、HH组在机械通气前1小时给予对照载体(Vehicle)腹膜内注射。2ME2组在机械通气前1小时给予抑制剂2ME2(5mg/kg)腹膜内注射。上述各组予以机械通气3小时后获取大脑海马区组织。2.2采用Western Blot法检测各组SD大鼠大脑海马组织中HIF-1a总蛋白以及核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白、occludin蛋白、claudin-5蛋白。采用免疫双荧光法检测SD大鼠大脑海马组织中HIF-1a蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白与星形胶质细胞(GFAP标记)共定位表达。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析;使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果:1、Western Blot实验提示:1.1 HIF-1a总蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间不存在交互作用效应(p>0.05);HIF-1a 核蛋白、AQP-4 蛋白、MMP-9 蛋白:低 O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(所有p<0.05),进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠大脑海马区HIF-1a总蛋白、HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平显著长于S组(所有P<0.05),HH组HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平显著长于H组(P<0.05)以及HC组(所有P<0.05)。予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平较HH组显著下降。1.2紧密连接蛋白:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(occludin蛋白:p<0.05;claudin-5蛋白:p<0.05),进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义((occludin蛋白:P>0.05;claudin-5蛋白:P>0.05),而H组SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平较S组显著减少(occludin蛋白:p<0.05:claudin-5蛋白:p<0.05),HH组SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平显著少于H组(occludin 蛋白:p<0.05;claudin-5 蛋白:p<0.05),以及 HC 组(occludin蛋白:p<0.05;claudin-5蛋白:p<0.05)。予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平较HH组显著上升。2、免疫荧光双标实验提示:单纯高碳酸血症不能引起SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞核内HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达增加,而予以低O2(16%)干预,可明显上调H组海马区星形胶质细胞核内HIF-1a核蛋白AQP-4蛋白、MMP-9蛋白的表达。予以低O2(16%)和高CO2(5%)干预,可以进一步提高HH组星形胶质细胞HIF-1a核蛋白AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达。予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平较HH组显著下降。结论:1、高碳酸血症可以进一步增加低氧血症大鼠大脑海马区星形胶质HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白的表达水平,同时会进一步增加海马区血脑屏障紧密连接蛋白occludin、claudin-5的降解。2、抑制HIF-1α蛋白核转录易位可以显著降低HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白的表达水平,同时抑制血脑屏障紧密连接蛋白occludin、claudin-5的降解。第五章 高碳酸血症促进低氧状态下星形胶质细HIF-1a蛋白核转入易位,对大鼠认知功能以及血脑屏障的影响目的:探索高碳酸血症促进低氧状态下星形胶质细HIF-1a蛋白核转入易位,对大鼠认知功能以及血脑屏障的影响。方法:1.药物配置1.1 甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol:2ME2,HIF-1 α 核转位的抑制剂)首先将2ME2溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,进一步在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行稀释,最终稀释的体积为2ml。2ME2组在机械通气前1小时给予抑制剂(5mg/kg,腹膜内注射)1.2对照载体(Vehicle)将DMSO在PBS中进行稀释,最终稀释成体积为2ml的对照载体。2、分组以及药物干预2.1 将SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组(S组:普通空气条件)、低氧血症组(H 组:84%N2+16%O2)、高碳酸血症组(HC 组:74%N2+21%O2+5%C02)、低氧合并高碳酸血症O(HH组:79%N2+16%O2+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症组+2ME2(2ME2 组:79%N2+16%O2+5%CO2)。其中 S 组、H 组、HC组、HH组在机械通气前1小时给予对照载体(Vehicle)腹膜内注射。2ME2组在机械通气前1小时给予抑制剂2ME2(5mg/kg)腹膜内注射。上述各组予以机械通气3小时后行MWM实验、EB实验以及BWC测定实验。2.2 MWM实验、EB实验以及BWC实验具体过程参见第二章、第三章方法部分。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析;使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果1、BWC测定实验:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(BWC:p<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠脑组织含水率之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组SD大鼠脑组织含水率显著长于S组(P<0.05),HH组SD大鼠脑组织含水率显著长于H组(P<0.05)以及HC组(P<0.05)。予以HIF-1α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组BWC较HH组显著下降(P<0.05)。2、EB渗漏测定实验:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应,(EB:p<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,SD大鼠伊文思蓝渗漏量之间的差异无显统计学意义(P>0.05),而H组SD大鼠伊文思蓝渗漏量显著长于S组(P<0.05),HH组SD大鼠伊文思蓝渗漏量显著长于H组(P<0.05)以及HC组(P<0.05)。予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组EB渗漏较HH组显著下降(P<0.05)。3、MWM实验:低O2(16%)干预和高CO2(5%)干预之间存在交互作用效应(48 h、72 h:所有P<0.05)。进一步行简单效应分析提示:S组和HC组相比较,逃逸潜伏期之间的差异无显统计学意义(48 h、72 h:所有P>0.05),而H组逃逸潜伏期显著长于S组(48 h、72 h:所有P<0.05),HH组逃逸潜伏期显著长于H组(48 h、72 h:所有P<0.05)以及HC组(48 h、72h:所有P<0.05)。予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预后,2ME2组逃逸潜伏期显著短于 HH 组(48 h、72 h:所有 P<0.05)。结论:予以HIF-1 α核转位的抑制剂2ME2干预低氧合并高碳酸血症大鼠可以减轻其神经认知功能障碍。第六章 高浓度CO2导致的酸性环境对SD大鼠BBB通透性调控相关蛋白、BBB通透性以及认知功能的影响目的探索高浓度CO2导致的酸性环境对SD大鼠BBB通透性调控相关蛋白、BBB通透性以及认知功能的影响方法:1、药物配置1.1 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)配置:7.28%Tris-base 2-3ml/kg,以等量 5%-10%葡萄糖液稀释1.2对照载体配置:生理盐水2-3ml/kg,以等量5%-10%葡萄糖液稀释后缓慢静脉滴入实验大鼠。2、实验分组:将SD大鼠按照随机数字表法分为:低氧合并高碳酸血症组(HH组:79%N2+16%02+5%CO2)、低氧合并高碳酸血症+Tris-base 组(Tris-base 组:79%N2+16%O2+5%CO2)。HH组在实验中通过尾静脉给予对照载体(Vehicle)静脉注射。Tris-base组在实验中通过尾静脉给予Tris-base静脉注射,同时抽取动脉血气纠正PH值7.35-7.45之间。2.1上述各组予以机械通气3小时后行EB渗漏实验、BWC测定实验以及MWM实验。2.2上述各组予以机械通气3小时后获取海马区脑组织提取蛋白。采用Western Blot法检测各组SD大鼠大脑海马组织中HIF-1a总蛋白以及核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白、occludin蛋白、claudin-5蛋白。采用免疫双荧光法检测SD大鼠大脑海马组织中HIF-1a蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白与星形胶质细胞(GFAP标记)共定位表达。使用重复测量方差分析对重复测量数据进行分析:使用析因设计方差分析评估低氧和高碳酸血症之间是否存在交互作用效应,如果两者之间存在交互作用效应,则进一步用简单效应分析的统计学方法评估各组是否存在统计学差异,以P<0.05作为统计学差异界值。结果:1、高浓度CO2导致的酸性环境对SD大鼠BBB通透性调控相关蛋白1.1 Western Blot实验提示:HH组与Tris-base组相比较:SD大鼠大脑海马区HIF-1a总蛋白、HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(P>0.05)HH组与Tris-base组相比较:SD大鼠大脑海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(P>0.05)1.2免疫荧光双标实验提示:HH组与Tris-base组相比较:SD大鼠大脑海马区星形胶质细胞中HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达水平之间的差异无显统计学意义(P>0.05)。2、高浓度CO2导致的酸性环境对SD大鼠血脑屏障功能的影响:HH组与Tris-base组相比较:SD大鼠EB渗漏、BWC之间的差异无显统计学意义(P>0.05)3、高浓度CO2导致的酸性环境对SD大鼠神经认知功能的影响:HH组与Tris-base组相比较:SD大鼠逃逸潜伏期之间的差异无显统计学意义(48 h、72h:所有 P>0.05)结论:1、低氧合并高碳酸血症导致的星形胶质细胞中HIF-1a核蛋白、AQP-4蛋白、MMP-9蛋白表达的变化与高浓度CO2导致的酸性环境无关。2、低氧合并高碳酸血症导致的SD大鼠海马区occludin蛋白、claudin-5蛋白的降解与高浓度CO2导致的酸性环境无关。3、低氧合并高碳酸血症导致的SD大鼠中血脑屏障的进一步破坏与高浓度CO2导致的酸性环境无关。4、低氧合并高碳酸血症导致的SD大鼠神经认知功能障碍的进一步加重与高浓度CO2导致的酸性环境无关。