研究背景：银屑病(Psoriasis)是最常见的慢性炎症性增生性皮肤病之一,易复发,病情顽固且可造成全身系统损害。其主要的组织病理学改变为新生血管形成、角质形成细胞过度增生及炎症细胞浸润。目前银屑病的病因和发病机制尚未完全明确,尚无有效根治方法,且其严重影响患者的生活质量,甚至生存周期,是现今国内外重点关注的疾病之一。早前的研究显示银屑病皮损新生血管生成为表皮角质形成细胞过度增生提供营养支持,同时炎症细胞通过高通透性的血管内皮进入病变组织,反之,炎症细胞浸润加速新生血管生成,三者相互形成正的反馈作用,导致银屑病病情反复发作与加重[2-3]。因此中断三者之间的恶性循环是治疗银屑病的有效途径之一。目前研究发现3种组织病理变化中真皮乳头血管的异常最先发生,之后才出现炎症细胞的移行和表皮的增生和分化。血管内皮生长因子(vaseular endothelial growth faetorVEGF)是目前发现的作用最强、最专一的直接促血管生成因子之一[4]。有研究指出：银屑病患者皮损内VEGF明显高于正常人和患者非皮损区,且皮损区VEGF浓度与银屑病病情严重程度呈正相关；VEGF mRNA及蛋白表达水平在正常人皮肤中几乎没有表达,而在银屑病患者皮损中表达量则明显增加；患者非皮损区VEGF mRNA蛋白水平表达也增加且发现有银屑病早期病理改变,将编码VEGF的基因转入小鼠皮肤可引起小鼠皮肤组织发生类似人类银屑病样改变,并出现特征性的Koebner现象,这进一步说明VEGF在银屑病发病过程中起到重要作用。另外VEGF的二个受体R1和R2的mRNA表达于银屑病活动期。银屑病患者经过系统药物治疗后,病情明显改善,患者皮损内VEGF mRNA的表达明显下降。也有研究指出：G一CSF、GM-CSF、bFGF、VEGF、TGF-a,β等能在体外诱导内皮细胞增生、迁移、管腔化,促使新生毛细血管的形成。这些均提示VEGF不仅在银屑病的发病中起重要作用,而且可以作为判断银屑病患者病情严重程度的指标之一,抑制患者血清和／或皮损VEGF的表达,阻断皮损新生血管生成可能是治疗银屑病有效的途径之一。研究人类疾病病因、发病机制、治疗方法的一种重要工具是动物模型,而银屑病罕见于任何非人类动物,且自然出现的病例极其少见,不适于进行科学研究。所以,银屑病动物模型的建立显得尤为必要。因此本实验包括两个方面：首先建立银屑病动物模型,其次采用实时荧光定量PCR方法检测白芍总苷对银屑病小鼠皮肤及外周血中VEGF mRNA的影响。目前而言银屑病的动物模型主要包括以下几种。1.1自发性动物模型自发性动物模型是指没有经过人工处理,实验动物在自然情况下产生的动物模型。其中鳞片状皮肤突变鼠、无毛突变鼠等,均能自发产生类似人类银屑病皮损及组织病理学表现。此模型主要被用于银屑病发病机制研究及药物筛选。目前自发性动物模型包括突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤疾病模型。但基因突变发生概率小,一般不会自发形成银屑病动物模型；近交系存活率低,因此该模型具有一定的局限性。1.2诱发性动物模型诱发性动物模型主要是通过一些物理或化学刺激(如紫外线照射、化学刺激剂、外涂药物等)加快动物的表皮增生的速度,诱发出类似人类银屑病样病理改变,但此模型只能模拟出部分银屑病组织病理学变化特点,与人类自发的银屑病还是存在比较大的差异,如GaylardeW建造心得安豚鼠银屑病样模型,,可出现角化不全、角化过度和棘细胞层肥厚等银屑病样的病理变化。1.3异体移植动物模型异体移植动物模型是将银屑病患者的患处皮损移植到动物体表而得到的动物模型,此模型能在较长时间内表现出银屑病样外观及组织病理改变。应用较广的是严重联合免疫缺陷鼠(SCID鼠)。但是异体移植动物模型存在局限性,该模型只能反应局部皮肤变化,不能在整体上模拟银屑病的发病过程,且建造过程较为复杂,因此其应用受到一定程度的限制。1.4生物医学型动物模型如小鼠尾部鳞片模型,该模型被用于评价药物对银屑病表皮颗粒层形成的影响,一旦药物能促使小鼠尾部颗粒层的形成,则认为该药物对银屑病有治疗的作用,另外小鼠阴道上皮模型主要用于评价药物抑制细胞过度增生的作用,Vanisi[12]利用小鼠阴道上皮模型评价了药物对其的抑制作用。1.5转基因动物模型转基因动物模型是指运用转基因技术把外源基因导入或内源性基因删除从而研究出来的动物模型。但银屑病的发病和多个基因有关,所以该模型只能反映出银屑病局部的病理生理特点,不能够完全表达与银屑病发病相关的各种因素。由于种种原因,以上的各种动物模型虽然均能从某些方面表现出银屑病的特征,但目前还没有一种动物模型能完整的模拟人类银屑病的各方面特征。咪喹莫特是一种新型的局部免疫调节剂,是全新的非核苷类异环胺类化合物,主要是通过与单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞表面Toll样受体(TLR)-7.8结合,磷酸化NF-kB的抑制性蛋白IKB,IKB构象发生改变从而与NF-kB分离,NF-kB得以活化。活化的NF-kB进入细胞核,与其相关的DNA基序结合诱导靶基因的转录,如炎症因子IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、G-CSF、GM-CSF、CCL4、CCL2、MIP-1等。这些细胞因子可启动获得性免疫应答,其中IL-12激活Thl型为主的细胞免疫,发挥抗病毒和抗肿瘤作用；IL-1、IL-6则启动初始T细胞向Th17细胞分化,Th17是一种新发现的能够分泌白介素17(interleukin17,IL-17)的T细胞亚群,在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。目前Th17细胞主要效应分子IL-17被证实能够上调VEGF、CD31等因子表达,从而促进血管增生。陆续有文献报道,应用咪喹莫特治疗尖锐湿疣、黑色素瘤或鲍温病等疾病时,患者原本稳定的银屑病病情出现加重的趋势,甚至无银屑病病史的患者也出现了银屑病样皮损,并且皮损的严重程度与药物剂量或使用时间呈明显正相关。如Leslie等在BALB/c小鼠背部皮肤每天规律地涂抹5%咪喹莫特乳膏,5天后发现涂抹部位出现典型的银屑病样皮损及组织病理改变。因该模型具有操作简单,消耗较少等优点,我们选用该模型进行试验。维A酸类、免疫抑制剂,生物制剂等是目前临床上主要用于治疗银屑病的药物和方法,虽可取得一定的疗效,但有一定的副作用,且无法达到根治的要求。虽然几十年来银屑病的治疗已经取得了很大的成就,但目前尚无特别理想的治疗药物和方法,中医药是我国传统医学的一大宝库,副作用小,且部分中药已证实在自身免疫性疾病中多环节、多途径的发挥其免疫调节作用,复发率低,在自身免疫性疾病特别是银屑病治疗中显示出独特的应用前景。白芍是毛莨科植物芍药的干燥根,它的主要药效成分被称为白芍总苷(TGP),包括芍药苦、羟基芍药苷、芍药花苷、苯甲酰、芍药苷和芍药内酯苷,其中芍药苷占90%以上。中医认为它有养血柔肝、缓解止痛和敛阴收汗的功效,广泛应用到多种疾病的治疗。临床应用和药理研究发现,白芍总苷具有消炎镇痛、调节免疫、保护肝脏及血管内皮等作用和较小的副作用。在多种自身免疫性疾病中如银屑病、RA、SLE、强直性脊柱炎中得到广泛应用。近年来有多项研究认为,TGP参与了自身免疫过程的多个环节：(1)在二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠慢性皮炎-湿疹模型中,白介素(IL)-2水平降低,IL-4水平升高。而李传应等通过使用TGP处理模型小鼠,发现其IL-2水平能上升,而IL-4水平下降,其可能机制为TGP能够调节Thl分泌IL-2和Th2分泌IL-4之间的平衡,它通过上调Thl抑制Th2的功能发挥免疫调节作用。(2)TGP参与了G蛋白-腺苷酸环化酶-cAMP信号转导通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路,通过这两条通路调节细胞因子发挥作用。(3)TGP能够下调肿瘤坏死因子(TNF)-a、IL-6、IL-8、干扰素(IFN)-a等炎症因子的表达。TGP被用于SLE的治疗时有明显疗效,祝玉慧等在使用糖皮质激素和免疫抑制剂的基础上加用TGP治疗活动期SLE,结果发现TGP的使用可以明显减少激素的用量。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径在细胞分化、增殖、凋亡、应激等多种生理和病理过程中发挥着极其重要的作用,如炎症及免疫反应等,是哺乳动物细胞中重要的信号通路,其能把多种由细胞外刺激产生的信号通过级联反应从细胞膜传递到细胞核内。其任一环节的异常都可能导致细胞的异常增殖与分化。MAPK激酶激酶(MAPKkinasekinase,MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKkinase,MAPKK)、MAPK是主要的MAPK信号转导通路。此通路的反应模式主要是三级酶联：首先通过激活因子激活MAPKKK,激活的MAPKKK又通过磷酸化MAPKK使其被激活,产生MAPK并激活其它一系列蛋白激酶,引起细胞骨架成分磷酸化,亦使核内转录因子通过核转位进入细胞核而被激活,调节转录因子的靶基因,完成对细胞刺激的反应。三级酶联反应的刺激因子包括：细胞因子、生长因子、激素以及各种应激刺激。MAPK途径的核心是MAPK,其底物绝大部分是核内转录因子。MAPKS主要包括3个经典的亚家族途径,即细胞外调节激酶1/2(ERKI/2)、 p38MApK(p38mitogen-aetivatedProteinkinase,p38MAPK)(?)c-Jun氨基末端激酶(e-Junamino-terminalkinases,JNK)o P38在角质形成细胞的增生和分化中发挥重要作用是MAPK的亚类之一,炎性细胞因子和环境应激刺激是激活P38的主要刺激物,更值得关注的是p38的激活与炎症因子TNF-a、IL-1、IL一6的产生密切关系。早前研究表明p38MAPK途径在银屑病的病理过程中发挥着非常重要的作用。有研究报道TGP能够抑制p38MAPK,并通过抑制p38MAPK的激活,调节前炎症介质TNF-a、IL-1的产生达到抗炎的作用,表明TGP的治疗作用可能通过调节信号通路途径。因此,为了进一步探讨TGP治疗银屑病的作用机制,我们选择了p38MAPK信号途径来讨论TGP作用的可能机制。对银屑病病人或银屑病动物模型中VEGF表达的影响,目前国内多用酶联免疫吸附(ELISA)法、免疫组织化学方法进行观察,并采用计算机图像分析的方法对VEGF的表达量进行定量分析。细胞因子量的改变常常与移植排斥、炎症反应、自身免疫性疾病有密切的关系,它是一种调节蛋白。在蛋白质水平的检测需要达到一定量的组织样本,由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足。就算ELISA等常用的蛋白质检测方法的灵敏度也很难检测出极微量的蛋白产物。免疫组织化学方法虽然也有定量,准确等优点,但由于操作过程烦琐,持续时间长,技术要求较高等缺点,限制了其临床应用。因此应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。实时定量PCR技术作为一门新兴的技术,因其具有显著的优越性,不仅已在分子生物学的各个领域得到广泛的应用,而且也开始应用于临床上作为一种诊断手段。其应用的范围包括了：DNA、 RNA和病毒荷载量的定量、核酸多态性分析、基因突变分析等多个领域。Wellmann等[22]指出目前实时定量PCR技术在分析VEGF不同剪接体中较其他传统方法半定量竞争性RT-PCR表现出了许多优越性,包括特异性、敏感性、降低交叉污染以及更快速、更精确、更适用大量样本的同步量化等。相信它将成为研究VEGF在银屑病诊断与治疗方面一个很有前途的工具。TGP在银屑病的治疗中发挥重要作用,可以减轻炎症反应和缓解病情,但关于其在银屑病中的作用机制仍不清楚,是否TGP通过抑制VEGF mRNA表达和分泌以及调控信号通路来实现治疗作用。为探讨TGP治疗银屑病的可能机制,本研究拟通过实时荧光定量PCR检测正常BALB/c小鼠及TGP给药处理后的银屑病小鼠,背部皮肤组织及外周血VEGF mRNA的表达情况,分析TGP治疗与VEGF mRNA的相关性,以深入了解TGP在银屑病的可能的作用机制,为TGP在临床上更好的应用提供依据。目的：1.建立银屑病动物模型。2.研究TGP对BALB/c银屑病小鼠皮肤组织及外周血VEGF mRNA表达的影响,从而探讨TGP治疗银屑病可能作用的靶点及机制。方法：1.动物造模在微生物、免疫学及其它试验中,经常需要去除小鼠身上的软毛,用于实验研究。目前,采用的小鼠去毛方法为剪除法及脱毛剂脱毛。这两种方法不仅麻烦,还易于造成小鼠皮肤损伤,而且去毛不彻底。为此,我们采用了一种新的剃毛方法,即电推剪与电动剃须刀剪毛术,可避免上述缺点。将60只BALB/c小鼠随机分成6组,每组10只：空白组、阳性对照组、A、B、C及D组。电动剃须刀剪毛后,用5%咪喹莫特乳膏涂抹于除空白组外其余每只小鼠背部裸露皮肤,50mg/只,1/日建立银屑病动物模型。2.造模评价与正常对照组相比,IMQ涂抹1d后模型组皮肤即出现红斑；2～3d出现鳞屑,4-5d最严重；6d皮损稍好转,7-8d皮肤再次加重并增厚。病理切片示：皮肤出现角化过度、角化不全、棘层肥厚和角质层内多形核细胞浸润等类似人类银屑病的组织学改变。3给药方法按照《人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表》及TGP商品药帕夫林常规剂(1200～1800mg/60kg·d)计算,并参阅以往实验结论,分别灌胃给药。空白组：生理盐水灌胃,0.2ml/10g每天一次阳性对照组：生理盐水灌胃,0.2ml/10g每天一次A组：建模的同时每只小鼠给予TGP悬液50mg/kg灌胃每天一次B组：建模的同时每只小鼠给予TGP悬液100mg/kg灌胃每天一次C组：建模的同时每只小鼠给予TGP悬液200mg/kg灌胃每天一次实验第8天全部处死,收集小鼠背部裸露的皮肤组织及血液。D组：建模第8天后,继续用5%咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部裸露皮肤,并开始给予TGP悬液每只100mg/kg,灌胃给药每天一次直至皮损完全消退后处死,收集小鼠背部裸露皮肤组织及血液。采用实时荧光定量PCR方法分别检测各组小鼠皮肤组织及外周血VEGFmRNA的表达量。4.制作组织切片并HE染色4%中性甲醛溶液固定小鼠皮肤组织15h后,流水冲洗组织2小时。(1)脱水和透明：50%乙醇、70%乙醇6小时、85%乙醇3小时、95%乙醇及无水乙醇梯度脱水各2小时,二甲苯透明2小时。(2)浸蜡和包埋：在60恒温箱液态石蜡中浸泡4小时,然后包埋。(3)切片：5μm厚度切片。(4)HE染色：二甲苯脱蜡20分钟、依次从无水乙醇、95%、85%、75%乙醇、蒸馏水水化各2-5分钟、苏木素-伊红染色、再脱水、透明、中性树胶封片。光学镜下观察小鼠背部皮肤组织病理改变。HE染色切片,在光学显微镜10(目镜)×20(物镜)视野下观察。结果：1.一般情况用药前各组小鼠在实验期间摄食正常,毛发正常,活动自如；随着时间的推移,除空白组外其余各组小鼠逐渐出现精神倦怠、喜蜷卧、摄食减少及体重下降。但无明显毛发脱落,仅毛发光泽度较前有所下降。咪喹莫特涂抹背部皮肤时出现焦躁和反抗,且变得凶残好斗,其中C组一只小鼠被同组其他小鼠咬死。毛发光泽度下降。D组经TGP治疗后,随着皮损的消退,小鼠精神好转,摄食量也增加。实验过程中各组小鼠口、眼、耳、鼻均未见异常分泌物；大便无稀烂,尿量未见异常,尿液澄清透明。2.小鼠皮肤组织的变化与正常对照组相比,IMQ涂抹1d后模型组皮肤即出现红斑;2-3d出现鳞屑,4-5d最严重;6d皮损稍好转,7-8d皮肤再次加重并持续增厚,病理切片示：皮肤出现角质层增厚见角化不全,颗粒层变薄,棘层肥厚,表皮嵴延长等类似人类银屑病的组织学改变。D组小鼠经100mg/kg·d的白芍总苷灌胃治疗后,第7天皮损完全消退,HE染色切片：皮肤组织表皮及真皮大致正常,未见角质层增厚,角化过度及角化不全等。3.小鼠皮肤组织及外周血VEGF mRNA表达用药后第8天,阳性对照组皮肤组织中VEGF mRNA表达水平明显高于空白组(P=0.004),外周血VEGF mRNA表达水平也明显高于空白组,差异有统计学意义(P=0.000)。皮肤组织中：B,C,D三组VEGF mRNA的表达量均小于阳性组,差异有统计学意义(P(0.05)；三组与空白组比较,差异均无统计学意义(P)0.05)；A组VEGF mRNA的表达量高于空白组,差异有统计学意义(P(0.05),A组与阳性组差异无统计学意义(P)0.05)。外周血：A, B, C, D四组VEGF mRNA的表达量分别与阳性组和空白组比较,差异均无统计学意义。4.相关性分析白芍总苷的浓度与皮肤组织VEGF mRNA的表达量存在负相关(Kendall’s tau_b:r=-0.312p=0.036; Spearman’s rho:r=-0.383p=0.040)但相关性不显著r<0.50；而与外周血VEGF mRNA的表达量不存在相关性(Kendall’s tau_b: r=0.012p=0.936; Spearman’s rho:r=0.012p=0.951)结论：1.咪喹莫特外涂小鼠背部皮肤,出现类似人银屑病样改变。经HE染色,小鼠背部皮肤出现角质层增厚见角化不全,颗粒层变薄,棘层肥厚,表皮嵴延长等组织学改变,这与以往的研究结果一致,说明咪喹莫特能够刺激小鼠背部皮肤建立银屑病模型。经实时荧光定量PCR检测发现：咪喹莫特能上调小鼠皮肤组织和外周血VEGF mRNA的表达。2.TGP治疗后可降低银屑病小鼠皮肤组织VEGF mRNA表达量,并可延缓病情进展,但对外周血中VEGF mRNA表达无明显影响。因此我们推测TGP对银屑病的治疗作用可能与其能降低小鼠皮肤组织VEGF mRNA表达有关。3.TGP的浓度与皮肤组织及外周血中VEGF mRNA相关性分析,发现两者相关性不显著。4.本课题有助于深入了解VEGF在银屑病发病中的作用以及TGP对其的影响,为今后进一步的研究、开发针对银屑病炎症中的细胞信号转导途径中相关的、潜在的药物作用靶点的抗银屑病药物在临床应用提供理论依据。