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鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci,Cps）是引起宠物鸟和家禽呼吸系统疾病的一种重要病原体。宠物鸟主人、兽医和家禽从业人员很容易感染来自动物的鹦鹉热嗜衣原体而患病。由于其症状与普通感冒很相似,在临床上常常不易发现而被误诊,导致该疾病得不到及时有效的治疗,致使鹦鹉热嗜衣原体在患者体内持续存在并引起更严重的并发症,如肺炎、肺水肿、心肌炎和心内膜炎等。因此,研究鹦鹉热嗜衣原体致病的分子机制,阐明相关毒力效应蛋白的致病作用,对预防和控制鹦鹉热嗜衣原体感染有着极其重要的意义。Ⅲ型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）效应蛋白在衣原体致病过程中发挥了非常重要的作用。例如:包涵体膜蛋白（Inclusion membrane protein,Inc）,易位性复原活动磷酸化蛋白（Translocated actin-recruiting phosphoprotein,Tarp）和Ct 694介导沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）与宿主细胞相互作用,影响宿主细胞正常代谢与功能。鉴于衣原体各种属之间的相似性,筛选鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白以及研究其生物学特性能够为鹦鹉热嗜衣原体与宿主细胞相互作用提供重要的实验依据。因此,为了研究鹦鹉热嗜衣原体致病的分子机制和阐明鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白的致病作用,我们进行了以下三个部分的研究。第一部分鹦鹉热嗜衣原体T3SS激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症反应研究鹦鹉热嗜衣原体是一种严格胞内寄生的人兽共患病病原体,通常是由鸟类传染给人,导致呼吸道感染等多种疾病。目的:初步探讨鹦鹉热嗜衣原体T3SS调节宿主细胞炎症反应的作用及其分子机制。方法:采用体外感染模型,鹦鹉热嗜衣原体感染不同试剂（包括T3SS抑制剂INP0007、ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB202190和Fe SO4）预处理的人单核细胞株THP-1细胞,利用ELISA和Q-PCR方法分别检测炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）的蛋白和m RNA表达水平,Western blotting检测ERK、JNK和p38磷酸化水平。结果:T3SS抑制剂INP0007抑制鹦鹉热嗜衣原体的生长,降低THP-1细胞IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β炎症因子的产生,而外源性铁可逆转INP0007对鹦鹉热嗜衣原体生长的抑制作用,但是并不能恢复INP0007对炎症因子的抑制作用;ERK和JNK抑制剂能减少鹦鹉热嗜衣原体诱导炎症因子的产生,但是p38抑制剂不能减少鹦鹉热嗜衣原体诱导炎症因子的产生。结论:鹦鹉热嗜衣原体诱导炎症因子的产生与T3SS有关,且鹦鹉热嗜衣原体T3SS通过激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症反应。第二部分鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白的筛选与鉴定研究目的:初步筛选和鉴定鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白。方法:利用生物信息学的方法,并结合相关文献对鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白进行筛选,初步预测了CPSIT0018、CPSIT0531、CPSITp7三种鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白编码基因;采用PCR技术从Cps6BC基因组中扩增CPSIT0018、CPSIT0531和CPSITp7基因,并构建p ET30a-CPSIT0018、p ET30a-CPSIT0531和p ET30a-CPSITp7原核表达载体,然后分别转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG分别诱导His-CPSIT0018、His-CPSIT0531和His-CPSITp7三种融合蛋白的表达,分别免疫BALB/c小鼠制备对应的多克隆抗体,ELISA分析三种蛋白的免疫原性,间接免疫荧光法观察CPSIT0018、CPSIT0531和CPSITp7蛋白在He La细胞中的分布。结果:成功构建了p ET30a-CPSIT0018、p ET30a-CPSIT0531和p ET30a-CPSITp7三个原核载体,并表达和纯化出较稳定的重组蛋白;His-CPSIT0018、His-CPSIT0531和His-CPSITp7三种蛋白均可刺激小鼠产生特定的免疫反应,随着免疫次数的增加抗体滴度逐渐升高,其中CPSITp7免疫原性最强,抗体滴度为1:1 000 000,而CPSIT0018和CPSIT0531免疫原性相对较弱,抗体滴度均为1:640 000;CPSIT0018和CPSIT0531蛋白均定位在鹦鹉热嗜衣原体的包涵体内,与主要外膜蛋白MOMP的分布模式相似,而与包涵体膜蛋白Inc A的分布模式不同,CPSITp7蛋白不仅局限于包涵体内,在 He La细胞胞浆中也可以见到其分布,用T3SS阻断剂干扰细胞后,CPSITp7的分布发生改变,仅位于包涵体内,而CPSIT0018和CPSIT0531的分布没有明显的改变。结论:1)获得了纯化的Cps重组蛋白His-CPSIT0018,His-CPSIT0531和His-CPSITp7;2)CPSIT0018,CPSIT0531和CPSITp7重组蛋白均具有较好的免疫原性,能刺激BALB/c小鼠产生较高效价的抗体,其中CPSITp7免疫原性最强;3)CPSITp7是一种鹦鹉热嗜衣原体T3SS效应蛋白,而CPSIT0018和CPSIT0531可能是鹦鹉热嗜衣原体菌体上的结构蛋白。第三部分CPSITp7激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症反应研究目的:初步探讨鹦鹉热嗜衣原体蛋白CPSITp7在调节宿主细胞炎症反应的作用及分子机制。方法:用多粘菌素B去除CPSITp7溶液中的内毒素后,用CPSITp7蛋白刺激THP-1细胞,或30μM ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB202190分别预处理的THP-1细胞0 h、6 h、12 h、24 h和36 h,Western blotting检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,ELISA检测各种炎症因子的表达水平。结果:浓度为010μg/m L CPSITp7蛋白刺激PMA诱导的THP-1细胞24 h后,随着CPSITp7浓度升高,IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α的含量呈剂量依赖性增加;10μg/m L的CPSITp7处理细胞,在24 h时IL-6、IL-8和IL-1β表达水平达到高峰,而TNF-α在12 h就达到高峰;CPSITp7蛋白处理细胞后其ERK和JNK磷酸化水平显著升高,p38磷酸化水平变化不明显;JNK和ERK阻断剂能明显降低CPSITp7蛋白诱导的IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α表达。结论:CPSITp7通过JNK/MAPKs和ERK/MAPKs信号传导途径诱导THP-1细胞产生IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子,与p38/MAPKs信号传导通路无关。