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罗非鱼是我国重要的淡水养殖对象,但近年来由于罗非鱼链球菌病的暴发,严重威胁到罗非鱼产业的健康可持续发展.目前尚未研制出有效的防治措施.开展罗非鱼免疫相关基因的功能分析工作,阐明罗非鱼的免疫调控机制,为进行抗病相关标记的筛选,辅助抗病罗非鱼品种的选育提供基础数据,对于罗非鱼链球菌病的防治工作具有潜在的应用价值.先天免疫在鱼类免疫反应中起重要作用.模式识别受体是先天免疫受体的重要成员.模式识别受体与病原相关分子模式的相互作用,是先天免疫反应的第一步.目前发现模式识别受体有三家家族:Toll样受体(Toll-like receptor,TLR),NOD样受体(NOD-like receptor,NLR),RIG样受体(RIG-like receptor,RLR).Toll样受体是了解的最清楚的,其在多种传染病中的功能都得到了很好的解释.NLR和RLR家族基因了解的还比较少,尤其是在低等脊椎动物. 本论文从 NLR 和 RLR 受体基因入手,克隆得到尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)NLRs(NOD1,NOD2和NLRC3)和RLR(MDA5, LGP2和IPS-1)基因的全长cDNA及基因组序列,实时定量PCR检测其在各组织和器官及胚胎发育过程中的表达量以及感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后表达的变化;构建各基因真核表达载体,并研究哺乳动物细胞中过表达上述基因后,对 NF-κB 活性的影响;用克隆测序的方法分析IPS-1和NOD1基因多态性以及该基因多态性与罗非鱼无乳链球菌病抗性的关系,为罗非鱼抗病品系选育提供理论基础.主要结果和结论如下: 1.尼罗罗非鱼NLRs基因的克隆、表达特征及其功能分析 采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术得到RLRs的cDNA序列,并用特异引物直接扩增法获得其基因组序列.尼罗罗非鱼 NOD1(OnNOD1) ,NOD2(OnNOD2), NLRC3 (OnNLRC3)cDNA序列全长分别为3924bp,3886bp, 4574bp.分别编码941,986,1130个氨基酸.NOD1基因组序列14138bp(GenBank登录号:MF479261),包含12个外显子;NOD2基因组序列5851bp(GenBank 登录号:MG680275),包含11个外显子;NLRC3基因组序列17335bp(GenBank登录号:MG680276),包含19个外显子.3个NOD样受体均具有NACHT domain和C-末端富亮氨酸重复区域.另外,NOD1和NOD2还具有N-末端CARD domain.系统进化树分析显示:3个RLR基因高度保守.组织表达分析显示:3个受体均在脾脏中高表达.3 个受体在受精后不同发育时期的表达情况显示:NOD2 和NLRC3从受精后2-8 d,表达量持续上升.NOD1的表达量,受精后2-6 d持续上升,第7 d下降,然后第8 d又出现上升.腹腔注射无乳链球菌后,NOD1, NOD2 和NLRC3的表达量在血液、脾脏、肾脏、肠和鳃组织中均出现不同程度的变化.而且,与NF-κB报告质粒共转染HEK293细胞后,NOD1过表达可以增强NF-κB的活性,NOD2和NLRC3则对NF-κB活性无影响.然而,MDP处理后,NOD2和NLRC3过表达显著增强NF-κB的活性.亚细胞定位显示:NOD1和NLRC3主要在细胞质中表达,NOD2却在细胞质和细胞核中均有表达.这些结果显示:NLRs基因功能非常保守,在抵御无乳链球菌感染方面发挥重要作用. 2.尼罗罗非鱼RLRs基因的表达特征及其功能分析 采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术得到RLRs的cDNA序列,并用特异引物直接扩增法获得其基因组序列.尼罗罗非鱼MDA5基因编码974个氨基酸,包含两个CARDs,一个DExDc域(DExD / H盒包含域),一个HELICc(解旋酶家族C-末端)结构域和C-末端调控结构域(RD);LGP2基因编码679个氨基酸,包含一个DExDc,一个HELICc和一个C-末端调控结构域.IPS-1基因编码556个氨基酸,包含一个CARD,一个富含脯氨酸的结构域,一个跨膜螺旋结构域和一个假定的TRAF2结合基序(269pvqdt273).系统进化树分析表明,所有的3个基因与来自其他硬骨鱼类的相应基因聚集在一起.实时定量 PCR 分析表明,3个基因在尼罗罗非鱼的所有组织中均有表达.MDA5的表达水平在血液中最高,在肝脏中的表达水平最低,而IPS在肾脏中的表达水平最高.检测到LGP2在肝脏中的表达水平最高.这些RIG-I样受体(RLRs)在不同发育阶段中的表达模式显示: MDA5表达的最高水平发生在受精后2 d (dpf),从3到8 d,表达量明显降低.LGP2的表达水平,从受精后4到8 d显著增加.IPS-1 mRNA的表达水平则从受精后2到8 d保持稳定.经腹腔注射无乳链球菌后,MDA5在肠和脾脏中的表达水平先上升,再下降,然后又上升; LGP2 在肾脏和肠中表达上调,IPS-1在脾中的表达上调.293T细胞中,IPS-1 过表达可以增强 NF-κB活性(P＜0.05),与MDA5共转染后,IPS-1依赖的NF-κB的活性略有增加(P＞0.05).这些结果表明,虽然推测的MDA5蛋白结构与其他RLR成员在进化上是保守的,其信号转导功能明显不同.细胞亚定位显示:MDA5和IPS-1均匀的分布在293T细胞中的细胞质,而LGP2分布在整个细胞质和细胞核.这些结果有助于阐明尼罗罗非鱼对细菌感染的先天免疫反应. 3.尼罗罗非鱼IPS-1基因SNP位点的筛选及其与无乳链球菌抗性的关联分析 抗病相关SNP 标记的筛选是抗病选育的基础与前提.为获得与尼罗罗非鱼无乳链球菌抗性性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymophisms, SNPs)标记,本研究通过克隆测序或PCR产物直接测序法,从20 个亲本家系的39尾尼罗罗非鱼的β干扰素启动子刺激物1(interferon-b promoter stimulator 1, IPS-1)基因的测序序列中筛选得到36个SNPs 位点.通过snapshot 分型法对子代中的无乳链球菌敏感群体(susceptible group,SG)(82尾)和抗性群体(resistance group, RG)(84尾)进行分型,并利用Popgen32软件统计分析IPS-1基因各SNPs位点在两个群体的多态性和遗传参数,结果显示,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.02~0.37,所检测SNPs位点呈现出低度或中度多态.通过 SNP 位点与无乳链球菌抗性/敏感性状之间的关联分析,发现位点 S8 (T-3059C)与无乳链球菌敏感性状显著相关(P＜0.05).利用Haploview 4.2软件分析IPS-1基因中的36个SNPs位点所形成的单倍块和连锁不平衡情况,结果显示, 36 个 SNP 位点可构成 6 个单倍块和 22 个单倍型;其中单倍块 2 中的单倍型H2-3(GTTG) 和 单 倍 块 3 中 的 H3-4(TTDGTTGAGCGCCA) 、H3-2(CCDGTTGAGCGCCA) 3个单倍型与尼罗罗非鱼无乳链球菌敏感性状显著相关(P＜0.05),单倍块 3 中的单倍型 H3-5(TCDGTTGAGCGCCA)则与尼罗罗非鱼无乳链球菌抗性性状显著相关(P＜0.05).上述结果表明,筛选到的尼罗罗非鱼IPS-1 基因的1个SNPs位点和4个单倍型可作为抗无乳链球菌病尼罗罗非鱼选育的候选分子标记.该研究可为抗无乳链球菌病尼罗罗非鱼新品系的选育提供了资料基础. 4.尼罗罗非鱼NOD1基因SNP位点的筛选及其与无乳链球菌抗性的关联分析 为获得与尼罗罗非鱼无乳链球菌抗性性状相关的单核苷酸多态性标记,本研究通过克隆测序或PCR产物直接测序法,从20个亲本家系的39尾尼罗罗非鱼的NOD1基因的测序序列中筛选得到44个SNPs 位点.通过snapshot分型法对子代中的无乳链球菌敏感群体(susceptible group, SG)(83尾)和抗性群体(resistance group, RG)(83尾)进行分型,并利用Popgen32软件统计分析NOD1基因各SNPs位点在两个群体的多态性和遗传参数,结果显示,对44个位点中的24个位点进行了成功分型.24个位点的多态信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.09~0.37,所检测SNPs位点呈现出低度或中度多态.通过SNP位点与链球菌抗性/敏感性状之间的关联分析,发现位点SNP5(G-2284C)、SNP13 (G-8956C)与无乳链球菌抗性性状显著相关(P＜0.05), SNP12(G-8955C)与无乳链球菌敏感性状显著相关.利用Haploview 4.2软件分析IPS-1基因中的24个SNPs位点所形成的单倍块和连锁不平衡情况,结果显示,24个位点可构成5个单倍块和16个单倍型;其中单倍块4中的单倍型H4-2(AC)与尼罗罗非鱼无乳链球菌抗性性状显著相关(P＜0.05).上述结果表明,筛选到的尼罗罗非鱼IPS-1基因的3个SNPs位点和1个单倍型可作为抗无乳链球菌病尼罗罗非鱼选育的候选分子标记.该研究可为抗无乳链球菌病尼罗罗非鱼新品系的选育提供了资料基础.