研究背景肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,80-90%为原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC),据相关研究数据统计,肝癌的发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第6和第3位,全球每年新增病例约为62.6万,死亡约为59.8万。肝细胞肝癌(简称肝癌)是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤,是人类主要的恶性肿瘤之一,其最主要的病因是病毒感染(如乙型肝炎病毒：hepatitis B virus, HBV;丙型肝炎病毒：hepatitis C virus, HCV)、非病毒因素(如：酒精及食物中黄曲霉毒素摄入)以及遗传性肝病、肝硬化等,在我国主要致病因素为乙型肝炎病毒感染。肝癌的发病机制目前仍然不是很明确,目前国内外学者一致认为抑癌基因的异常失活或癌基因的激活是造成肝癌发生的主要原因。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的小分子RNA,一般是在转录后水平对基因表达进行调控。近年来研究表明miRNA在健康和疾病调节方面有着重要的功能,目前已有研究发现,某些miRNA的异常表达,导致了肿瘤的发生和进展；还有研究结果证明,肝癌的发生、发展及对其治疗预后和复发,都与某些特定的miRNA表达异常有关。因此科研人员认为研究miRNA具有发现肝癌的发病机制、为其分子诊断提供依据、判断肝癌预后及提供新的治疗方案等潜在意义。近年来,miR-199a与肿瘤的关系受到了学者们的高度重视,miR-199a具有高度保守性,在不同肿瘤中表达存在着差异,与肿瘤的发生发展密切相关。如有学者对鼠的口腔癌模型组织中miRNA表达情况研究发现,miR-199a在癌组织中表达呈现下调趋势,因此判断口腔癌发病与miR-199a可能存在密切的关系,可以将其作为判断病情变化的重要参考指标之一。另有研究发现在肝癌组织中miR-199a可能通过调控目的基因的表达从而参与肝癌的发生和发展,miR-199a表达的恢复可能会抑制肝癌的发展。miR-21是致癌性miRNAs的一个典型例子。有研究发现,miR-21在众多肿瘤中存在着过表达的情况,包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、腺癌以及胶质细胞瘤等。miR-21的过表达能促进肝癌细胞的侵袭和迁移能力,因为磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)肿瘤抑制基因是miR-21的靶基因。miR-21类似于致癌基因的功能,因此也可以将其称之为致癌miRNA。miR-221是新发现的一种很有潜力的小RNA,其在众多肿瘤细胞(肝细胞肝癌、膀胱癌、乳头状甲状腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤)中均呈表达上调趋势,并证实可以通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)的表达,使肿瘤细胞由G1期进入S期,导致S期的癌细胞增多,从而促进癌细胞的生长。以上关于miRNAs在肝癌中差异表达的结果提示miRNA-21、miRNA-221及miRNA-199a可能成为肝癌临床诊断与治疗的潜在靶标。超声微泡造影剂作为一种新型基因转染载体、具有安全、稳定、高效等特点。它可以利用超声辐照的能量使微泡定位“爆破”,从而释放所携带的目的基因。同时微泡破裂产生的震荡和空化效应能够增高局部细胞的通透性,产生可逆声孔,促进目的基因进入细胞核,进而增加基因的转染及提高表达效率；此外,微泡具有保护作用,可以使所携带的基因或药物避免被血液中核酸内切酶和其它酶的降解,使其稳定通过血液循环系统并最终到达靶组织或靶器官；超声微泡的这种靶向作用很大程度上降低了对全身的不良反应。目前,超声微泡在基础研究和临床应用方面主要涉及增强组织血流灌注和肿瘤、血栓、炎症等显影；以及携药物、基因治疗,抗肿瘤治疗和溶栓治疗等领域,并取得了一定的成果。超声微泡技术在基因治疗中的应用已受到国内外学者的广泛关注,并有研究报道超声微泡能明显提高基因转染效率,虽然不同细胞或组织的辐照参数报道不一并还需再进一步研究,但它为肿瘤的治疗提供了新的方向。基于miRNA-21、miRNA-221及miRNA-199a的研究现状及其在肝癌癌变分子机制中的潜在意义,本研究目的在于明确超声微泡破裂介导反义miRNA-21与反义miRNA-221及miRNA-199a转染人肝癌HepG2细胞及其在miRNAs等基因转染方面的转染效率及安全性,探索异常表达的miRNAs在肝细胞肝癌发生发展过程中的作用及超声微泡介导的基因治疗方法的可行性。材料与方法1.构建肝癌中反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒载体；根据has-miR-21-5p与has-miR-221-3p序列分别构建相应的反义序列：TCAACATCAGTCTGATAAGCTA与GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT,美国国家生物技术信息中心(NCBI)查阅miRNA-199a-1的序列,构建反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒载体。2.应用噻唑蓝比色分析法(MTT)与台盼蓝染色两种方法检测超声六氟化硫(SF6)与全氟丙烷(C3F8)微泡对人肝癌HepG2细胞活性的影响并筛选出最优微泡转染浓度。HepG2细胞按1.0×104数量接种于96孔细胞培养板内,继续培养24h后观察,待细胞处于对数生长期及细胞贴壁生长面积占孔板的80%及以上时,用磷酸盐缓冲液(PBS)小心清洗细胞后,加入无血清的细胞培养基(DMEM)200μ1,加入相应体积的超声造影剂SF6与C3F8微泡,超声微泡浓度分别为：1%、5%、10%、20%。另设对照组和调零组,4h后换为含10%胎牛血清(FBS)的DMEM继续培养,24h后MTT法检测细胞活性,计算细胞存活率。不同微泡浓度下,取对数生长期的HepG2细胞,调整细胞浓度,以1x105/ml,每孔2ml,接种于6孔板中,另设对照组,台盼蓝染色观察细胞存活情况。3.超声造影剂六氟化硫与全氟丙烷微泡介导从前期构建的三种miRNAs质粒中随机选择的miRNA-199a质粒转染人肝癌HepG2细胞,通过荧光显微镜及流式细胞术观察并筛选最优的超声微泡介导miRNAs的转染条件。依照上一步实验方法处理细胞并按筛选出的最优微泡浓度分别在每组加入相应体积的SF6与C3F8微泡；分别加入4μg的miRNA-199a质粒；超声仪探头置于培养板下方,加少量耦合剂,超声造影模式下超声频率为2.0MHz,机械指数(MI)分别为0.12、0.20、0.28、0.35；分别对各组进行超声照射30s。转染后培养6-8h更换为含10%FBS的DMEM继续培养,转染24h-48h后荧光显微镜下根据标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的分布观察质粒转染情况,流式细胞术测定转染率,筛选出最优的超声微泡介导miRNAs转染HepG2细胞的条件。4.应用最优的超声微泡介导miRNAs转染条件,向人肝癌HepG2细胞转染反义mi RNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒,另设空白对照组、阴性对照组(单加空载质粒不加超声微泡不给予超声照射)。应用多聚酶链式反应(PCR)技术检测HepG2细胞内各基因表达情况。5.应用最优的超声微泡介导miRNAs转染条件,向人肝癌HepG2细胞转染反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒,另设空白对照组、阴性对照组。MTT法测定超声微泡介导miRNAs质粒转染HepG2细胞后细胞活性。6.膜联蛋白V-PE(Annexin V-PE)/7-AAD双染法及膜联蛋白V-PI(Annexin V-PI)双染法分别检测超声微泡介导miRNAs转染人肝癌HepG2细胞后HepG2细胞凋亡情况及细胞周期分布。应用最优的超声微泡转染条件向HepG2细胞转染反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒,另设空白对照组及阴性对照组。转染后培养6-8h更换为含10%FBS的DMEM继续培养,转染24h-48h后加入胰蛋白酶,小心收集细胞,加入适量7AAD液,室温避光反应5～15min,按照Annexin V-PE凋亡试剂盒说明进行操作,上机检测HepG2细胞凋亡情况；另小心收集细胞,加入适量PI染液,室温避光反应30min,上机,检测HepG2细胞周期分布。7.划痕实验及Transwell细胞侵袭实验检测超声微泡介导miRNAs转染人肝癌HepG2细胞后细胞的迁移能力。应用最优的超声微泡转染条件,向HepG2细胞转染反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒,另设空白对照组、阴性对照组。转染后4h更换为含10%FBS的DMEM继续培养。转染24h后枪头垂直紧靠直尺划竖痕,用PBS洗涤细胞3次,洗去划下的细胞,加入适量无血清的DMEM,放入37％、5%CO2培养箱孵育,按0h、12h时间点分别取样拍照；另制备transwell小室,消化细胞,配制并每孔加入细胞悬液,37℃培养箱中孵育20-24h,取出transwell小室固定、染色、前后PBS各洗涤两次,显微镜下观察,随机5个视野计数。8.应用最优的超声微泡转染条件,向人肝癌HepG2细胞转染反义miRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒后软琼脂培养克隆形成实验测定细胞克隆形成能力。应用最优的超声微泡转染条件,向HepG2细胞转染反义niRNA-21、反义miRNA-221及miRNA-199a质粒,另设空白对照组及阴性对照组。转染后4h更换为含10%FBS的DMEM继续培养。将1.2%低熔点琼脂糖与2xDMEM以1：1的体积混合制备0.6%底层琼脂,取1.4ml加入到6孔板各孔中,温室凝固。待前处理细胞生长处于对数期时,消化重悬细胞调整密度至1×104/ml,将0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM以1：1的体积混合制备上层琼脂,六孔板每孔加1ml上层琼脂及0.1ml细胞悬液,均匀,室温凝固,常规培养,显微镜下观察并计数直径大于100gm的细胞集落。结果1.以质粒GV249为载体骨架,用限制性内切酶和PCR方法构建表达反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a载体,使用质粒提取试剂盒提取重组质粒,经上海英骏生物技术有限公司测序,证明序列完全正确。2.MTT法和台盼蓝法检测人肝癌HepG2细胞结果一致,随着微泡造影剂浓度增高,细胞活性下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05),当微泡造影剂浓度小于10%时,六氟化硫和全氟丙烷两种微泡均不会引起明显的细胞死亡(细胞存活率>80%)；当微泡浓度达20%时,两种微泡均对细胞的杀伤力明显增强(细胞存活率<70%)；两种微泡对细胞毒性作用相当。3.体外转染目的基因质粒至人肝癌HepG2细胞,荧光显微镜法和流式细胞术检测细胞的转染率结果一致：①相同的超声频率和机械指数条件下,加入两种超声微泡造影剂均可显著提高基因转染率,质粒+超声+SF6组和质粒+超声+C3F8组显著高于质粒+超声组(P<0.05)；②保持其它转染条件不变,改变M1分别为0.12、0.20、0.28时,随着MI的增大转染效率增加,各组间差异具有统计学意义(P<0.05),当MI为0.35时转染效率显著下降,低于MI为0.20及0.28时转染率,差异具有统计学意义(P<0.05)；③单纯质粒不能进入细胞,超声辐照能促进质粒转染细胞,加入超声微泡造影剂后,转染效率显著提高,质粒+超声+SF6组在MI为0.28时转染率最高,达到(26.31±0.72)%,高于普通脂质体转染率(24.70±0.67)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.转染目的质粒后,HepG2细胞中miRNA-21及miRNA-221的表达均下调,且相对于空白及阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)；而HepG2细胞中miRNA-199a的表达明显上调,相对于空白及阴性对照组差异具有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组表达均没有统计学差异(P>0.05)。5.体外转染目的质粒至HepG2细胞,空白对照组和阴性对照组细胞的生长均未受到明显抑制,而反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a转染组细胞生长均受到抑制,与空白和阴性对照组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中mir-199a转染组的抑制效果最为显著,与反义miRNA-21/221两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。6.体外转染目的质粒至HepG2细胞,空白对照组凋亡细胞比例为0.46%；转染空载质粒后,凋亡细胞比例略有上升,但小于2%。转染目的基因反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a后,细胞出现凋亡,凋亡率分别为(7.49±+0.42)%,(7.96±0.33)%,(11.10±0.46)%,miRNA-199a细胞组出现凋亡峰,凋亡值最高,与其它组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。7.转染目的质粒后,细胞的迁移能力下降,迁移率均小于空白对照组的80%。对于含有目的基因反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a的实验组,细胞迁移能力分别为空白组的58.97%、46.60%、31.05%,其中miRNA-199a实验组对细胞迁移的干扰作用最强,与其它组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示转染目的质粒至HepG2细胞后,平均视野侵袭细胞均较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。而转染含目的基因质粒后平均视野侵袭细胞较阴性对照组和空白对照组显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05),其中miRNA-199a转染细胞组抑制效果最为显著,为38.67±4.51个侵袭细胞每平均视野,与其它组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。8.转染目的质粒后,反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a转染组细胞的克隆形成能力显著减弱,与空白和阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。其中mir-199a转染组的克隆数为105.67±5.86,抑制效果最为明显,与其它组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.MTT和台盼蓝法检测显示,当微泡造影剂浓度小于10%时,六氟化硫微泡和全氟丙烷微泡均不会引起明显的细胞死亡(细胞存活率>80%)。2.利用荧光显微镜与流式细胞术发现造影剂的最适宜的浓度(10%)下,造影模式下超声频率为2.0MHz, MI:0.28,超声辐照30s时,超声微泡转染率最高,其中质粒+超声+SF6组转染效率可达到(26.31±0.72)%,且显著高于传统的脂质体转染。3.体外转染反义miRNA-21、反义miRNA-221和miRNA-199a质粒至人肝癌HepG2细胞,检测各个指标发现：细胞生长受到抑制；细胞出现凋亡；细胞的迁移及侵袭能力下降；细胞的克隆形成能力显著减弱,其中mir-199a细胞组的各个实验效果最为显著。4.超声微泡介导反义miRNA-21/221及miRNA-199a质粒转染人肝癌HepG2细胞具有较好的转染效率,转染后肿瘤细胞的生长、迁徙和克隆形成能力都受到抑制,为miRNA的体内抑瘤实验打下了坚实的基础。