【背景】　　非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）以肝脏内甘油三酯（Triglyceride，TG）含量增加为主，可以进展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。在美国非酒精性脂肪性肝炎是导致肝硬化的一个很重要的原因，其相关的肝硬化也已经成为目前肝移植的第二大指征。在我国NAFLD发病率逐年升高，且呈现出年轻化趋势。　　NAFLD患者主要表现出肝脏中TG、胆固醇等脂类以脂滴的形式大量堆积而导致的脂肪变性，同时伴或不伴有外周血中TG、胆固醇等升高。脂肪变性的主要原因是肝细胞脂肪酸的摄取和TG的合成增加，TG分解和脂肪酸输出、氧化减少。因此，以脂滴形式储存的TG、胆固醇等脂质的分解障碍在NAFLD疾病发生发展过程中扮演重要角色。传统的脂滴分解主要指脂酶的脂解作用。而近年来自噬在脂解中的作用已被越来越多的研究证实。2009年自噬与脂滴脂解之间的联系首次被证实，研究发现，无论是在体内还是体外试验中，抑制自噬能够增加细胞内TG和脂滴的含量，自噬功能的丧失能够减少TG的分解。自噬主要包括大自噬、分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）和小自噬。CMA的具体过程是：热休克蛋白hsc70识别具有“KEFRQ”样膜体的胞浆蛋白，将其带到溶酶体并交给其膜上的lamp2a分子，lamp2a再将该蛋白转运入溶酶体内，被腔内的酶降解。其中lamp2a是CMA的核心分子。研究发现在体内阻断CMA，肝脏出现脂肪变性，聚集在肝脏的脂质不能被动员到外周。而CMA的底物是蛋白，所以其在脂代谢中的作用主要是通过调控脂滴包被蛋白来实现的。脂滴表面镶嵌有多种蛋白即脂滴包被蛋白，perilipins （plins）蛋白是非常重要的脂滴包被蛋白之一。Plins包括5个成员即plin1-5，这5个成员N端的100个氨基酸高度同源，它们的主要功能是调节细胞内脂质的储存和维持脂质稳态，但是又各有区别，且每个成员有着特定的组织分布、亚细胞定位和脂质结合性能。Plin5是该家族中的第5个成员，主要分布在心肌、骨骼肌、棕色脂肪及肝脏等高度氧化的组织。虽然肝组织中表达的plins不止plin5，但是由于plin5多样化的功能，其在肝脏脂解中发挥主导作用。且发现plin5在脂肪酸代谢的调节中表现出一些矛盾的角色，既增加甘油三脂的储存，又增加了脂肪酸的氧化。同时，plin5还可能参与了脂肪酸向线粒体转运氧化，影响线粒体的生物合成和功能调节。在这些功能方面，plin5与其他plins表现出了显著的不同。CMA作为脂代谢中的关键环节， plin5在脂代谢中的作用是否受其调控，且这种调控异常是否参与了NAFLD脂解障碍，目前尚未见文献报道。　　【目的】　　1. 明确CMA核心分子lamp2a及plin5在NAFLD病变中的表达情况；　　2. 证实CMA在脂滴降解中的作用及对plin5表达的影响；　　3. 阐明CMA降解plin5的分子机制。　　【方法】　　1. 利用Western-blot、免疫组织化学等方法检测非酒精性脂肪性肝病患者及脂肪肝小鼠模型肝组织中lamp2a与plin5表达情况；　　2. 以肝细胞系HepG2细胞为背景，构建lamp2a敲除的细胞系即HepG2-lamp2a(-)细胞系，检测lamp2a敲除对plin5表达及其细胞内脂滴分解的影响；　　3. 通过利用溶酶体抑制剂、激动剂处理HepG2细胞及HepG2-lamp2a(-)细胞，进而利用Western-blot检测plin5表达情况；　　4. 利用免疫共沉淀、免疫荧光染色等方法研究plin5是否通过CMA途径降解，从而影响脂质分解。　　【结果】　　1. Western-blot结果提示，NAFLD患者较正常人肝组织中lamp2a表达明显降低， plin5表达升高；免疫组化提示NAFLD患者lamp2a表达结果与Western-blot结果一致；qRT-PCR提示两组中lamp2a与plin5 mRNA均无差异。在脂肪肝小鼠模型中，Western-blot、免疫组化均提示肝组织中lamp2a表达明显降低、plin5表达明显升高；qRT-PCR提示plin5 mRNA水平无明显改变，lamp2a mRNA显著下降。　　2. 利用 CRISPR/Case9 技术成功构建以 HepG2 为背景的 lamp2a 敲除细胞系HepG2-lamp2a(-) ， Western-blot 结果提示常规培养的HepG2-lamp2a(-)细胞中plin5轻度升高；当给予油酸刺激8h时HepG2细胞、HepG2-lamp2a(-)细胞中plin5均同步升高；当撤掉油酸，用含血清的常规培养基继续培养16h时，HepG2细胞、HepG2-lamp2a(-)细胞中plin5均进一步升高; 当撤掉油酸，用不含血清的培养基继续培养16h时，HepG2细胞中plin5出现了明显的降解，而HepG2-lamp2a （-）细胞中plin5水平未见显著改变。同时，利用bodipy荧光染色发现细胞中脂滴的改变与plin5改变一致，即plin5水平升高时细胞内脂滴增加，plin5降低时细胞内脂滴也减少。进一步检测细胞中TG含量，结果提示其改变情况与plin5、脂滴变化情况一致。　　3. 分别用亮抑酶肽、氯喹两种溶酶体抑制剂处理HepG2、HepG2-lamp2a（-）细胞，结果发现溶酶体被抑制后HepG2细胞中plin5表达升高，而HepG2-lamp2a（-）细胞中plin5表达未出现明显改变，表明plin5降解依赖于溶酶体。　　4. Hsc70是CMA过程中的重要转运分子，免疫共沉淀结果提示plin5分子与hsc70分子存在相互作用；免疫荧光结果显示plin5分子与hsc70分子存在较好的共定位。　　【结论】　　本研究表明，plin5是CMA底物，其在脂质代谢方面的作用受CMA的调控。NAFLD中可能是CMA的核心分子lamp2a表达下降导致CMA途径障碍，进而导致plin5分子等脂滴包被蛋白降解异常，使得肝脏脂质分解异常。