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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma HCC)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,在东亚及我国尤为明显。HCC总体预后目前仍然很差,主要原因之一是术后较高的转移复发率,因此深入探索HCC转移复发机制及其关键调控环节对于改善HCC患者的预后以及为HCC治疗提供新的治疗靶点具有十分重要的意义。微小RNA是一类由内源基因编码的长度约22nt的非编码单链RNA分子,通过与靶基因的3’UTR(3’Untranslational region)互补配对导致的mRNA降解或翻译抑制,所以能在转录后水平上对基因的表达进行负调控,从而参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物过程,同时miRNA的异常表达也参与了一些肿瘤的发生和发展,目前许多研究证实一些miRNA在HCC的发生、细胞增殖和凋亡、肿瘤的血管生成、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。因此,miRNA可能作为HCC转移新的治疗靶点和预测治疗。miRNA221是近几年逐渐引起关注的一种肿瘤相关的miRNA,受其调控的靶基因以及这些靶基因的功能也在陆续地得到揭示,有研究利用miRNA芯片技术发现miR-221在原发性肝癌中高表达,提示miR-221在肝癌的发生中发挥重要作用,然而miR-221在HCC中潜在的分子机制目前仍然不是很清楚。本研究中,我们探讨了 miR-221对HCC的预测价值以及发生和发展中的功能,进一步阐明miR-221调控HCC的潜在机制。第一部分miR-221在人肝癌组织、肝癌细胞系中的表达水平及其对HCC预后的影响目的:本研究通过检测HCC组织、HCC细胞株中miR-221表达水平,评估miR-221与HCC转移复发的关系及其对HCC预后的影响。方法:利用Real-time RT-PCR检测156例HCC组织(包括40例配对的癌旁组织)以及HCC细胞株miR-221的表达水平、分析miR-221在HCC组织和不同转移潜能细胞株的表达情况。Kaplan-Meier法绘制HCC患者的累积生存时间以及无瘤生存时间曲线,以log-rank法进行了组间比较。采用Cox 比例风险模型进行单因素和多因素生存分析,确定miR-221表达水平是否为HCC独立的预后预测指标。结果:(1)miR-221在HCC细胞株表达显著上升,并且表达量与HCC细胞株转移潜能呈正相关,与正常肝细胞株相比,HCC细胞株miR-221表达水平都显著上升(P<0.01),低转移潜能组miR-221表达水平显著低于高转移潜能组(P<0.01)。(2)HCC组织miR-221水平与HCC的转移复发呈正相关:与相对应的癌旁组织相比,HCC组织miR-221表达水平显著增高(P<0.01),与无转移HCC组织相比,伴转移HCC组织miR-221表达水平显著增高(P<0.01),同时伴复发HCC组织miR-221表达水平显著高于无复发HCC组织(P<0.01)。(3)HCC组织中miR-221高表达的患者显示更短的总生存时间,两者之间比较有显著差异性(P=0.0002)。miR-221高表达的患者显示更高的复发率,两者之间比较有显著差异性(P<0.0001)(4)单因素、多因素分析提示miR-221是预测HCC患者预后的独立指标。结论:miR-221在HCC患者中表达上调,与HCC的转移和复发呈正相关。miR-221是HCC预后的一个独立预测指标。第二部分miRNA221调控REDD1以及mTOR信号通路对肝细胞癌侵袭和转移机制的研究目的:本研究通过对miR-221体外和体内功能试验的研究进一步验证并阐述miR-221参与调控HCC生长侵袭表型的相关分子机制。方法:通过慢病毒转染来沉默miR-221,获得稳定miR-221抑制细胞株HCCLM3,运用Transwell小室系统以及划痕实验来评价细胞的侵袭和迁移能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;MTT法检测细胞生长抑制率改变;细胞克隆实验来验证细胞的克隆能力,同时利用数据库靶基因预测以及双荧光素酶报告基因检测,找到miR-221下游的靶基因REDD1,并通过皮下成瘤模型,验证细胞的成瘤能力,利用RT-PCR、Western Blot、免疫组化技术检测mTOR通路相关分子的表达情况。结果:(1)miR-221沉默抑制体外HCC细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。(2)REDD1是miR-221下游的靶基因,miR-221表达沉默明显上调含有野生型的REDD1 3UTR的荧光素酶活动,而对含有突变型的REDD1 3’UTR的荧光素酶活动没有影响。(3)miR-221通过mTOR信号通路调节HCC侵袭,mTOR信号通路的关键明星分子包括PI3K、Akt、mTOR、PTEN等均受miR-221的调控,miR-221沉默后mTOR、Akt、PI3K、S6K1表达量下调,PTEN、4EBP1表达量上调.(4)miR-221沉默在体外促进HCC肿瘤生长。结论:miR-221在体内和体外调控HCC的生长、迁移、侵袭和转移,并通过REDD1及mTOR信号通路介导发挥对HCC的调控作用。